利用Cdna-AFLP分析白樺雄花早期表達(dá)基因.pdf

1、cDNA—AFLP是一種使差異表達(dá)基因(轉(zhuǎn)錄水平)可視化的新技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜和功能基因的研究,尤其用于篩選功能基因。以白樺雄花序?yàn)檠芯坎牧?優(yōu)化并建立了白樺cDNA-AFLP體系,進(jìn)而用此體系對(duì)白樺雄花發(fā)育早期和晚期差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。從得到的差異基因中篩選出白樺雄花發(fā)育早期的特異表達(dá)或早期表達(dá)量高的基因進(jìn)行測(cè)序和初步的生物信息學(xué)分析。從早期表達(dá)的基因中選出4個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè),檢測(cè)這4個(gè)基因在不同時(shí)

2、期及不同部位中的表達(dá)情況,并進(jìn)行基因功能的初步分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.優(yōu)化并建立了白樺cDNA—AFLP體系,預(yù)擴(kuò)增中Mg2+濃度為2mM,引物濃度為0.3μM,dNTP濃度為0.25mM,Taq酶濃度為1U,退火溫度控制在60℃時(shí),預(yù)擴(kuò)增的效果好。
　　 2.在白樺雄花早期、晚期花發(fā)育的基因表達(dá)譜中,總共顯示約7000個(gè)條帶,有858條是差異表達(dá)的,其中350個(gè)在發(fā)育早期特異表達(dá)或表達(dá)量明顯大于晚期,548

3、個(gè)在發(fā)育晚期特異表達(dá)或表達(dá)量明顯大于早期。篩選出白樺雄花早期表達(dá)信號(hào)強(qiáng)、重復(fù)性好的200個(gè)條帶進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序。通過(guò)比對(duì),有74個(gè)片段與已知的基因有相似性,其余片段均是未知功能片段。沒(méi)有比對(duì)上的序列占了很大的比例,可能是組織特異性表達(dá),或者因?yàn)槠翁?有可能片段位于5ˋ或3ˋ-UTR區(qū)域,不編碼蛋白,在蛋白水平上沒(méi)有功能。
　　 3.篩選獲得的74條EST序列被GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)收錄,收錄號(hào)為HS107072

4、-HS107145。通過(guò)BlastX對(duì)EST進(jìn)行功能注釋,并對(duì)其進(jìn)行功能分類,EST功能涉及了代謝、細(xì)胞組分、生長(zhǎng)和發(fā)育等途徑。注釋的EST序列都與已知花發(fā)育早期相關(guān)的基因有很高的同源性。這些EST的獲得為白樺雄花發(fā)育相關(guān)基因克隆和功能解析奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.從篩選的74個(gè)白樺雄花早期花發(fā)育的基因中,選出4個(gè)基因,即:β-酮酰輔酶A合成酶基因、乙醇脫氫酶基因、β-酮酰.ACP合成酶基因和雙極驅(qū)動(dòng)蛋白基因。以actin(肌動(dòng)蛋