半矮生型桃新梢生長(zhǎng)躍變期差異表達(dá)基因的cDNA-AFLP分析.pdf

1、桃是我國(guó)第三大落葉果樹(shù),栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。但是桃過(guò)大的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量不僅增加了管理難度、修剪用工和生產(chǎn)成本,而且造成樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)的大量浪費(fèi),這是桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。然而,目前生產(chǎn)上適合果樹(shù)簡(jiǎn)易化管理的優(yōu)良品種較為匱乏。半矮生型桃“SD9238”是在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所育種圃實(shí)生苗后代中發(fā)現(xiàn)的突變體,該突變體樹(shù)體僅為普通型的1／2—2／3,節(jié)間較短,果枝粗壯而長(zhǎng)度適中,年修剪量極小,是調(diào)控桃樹(shù)樹(shù)勢(shì)、實(shí)現(xiàn)樹(shù)體有

2、限矮化的理想基因資源。其早期生長(zhǎng)緩慢,5月中旬之后進(jìn)入迅速生長(zhǎng)期,與普通型截然不同。
　　 本研究以“SD9238”為研究試材,利用cDNA-AFLP差顯技術(shù)分析其新梢生長(zhǎng)躍變期前后4個(gè)生長(zhǎng)階段差異表達(dá)基因,獲得不同生長(zhǎng)階段基因表達(dá)的差異片段,對(duì)這些片段進(jìn)行分析、克隆和序列測(cè)定,并對(duì)這些基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能鑒定,然后通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,為進(jìn)一步揭示半矮生桃生長(zhǎng)調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。主

3、要研究結(jié)果如下:
　　 (1)建立并優(yōu)化了半矮生桃新梢的RNA提取技術(shù)體系和cDNA-AFLP技術(shù)體系。
　　 (2)對(duì)半矮生桃新梢生長(zhǎng)躍變期4個(gè)不同生長(zhǎng)階段的基因表達(dá)差異進(jìn)行了cDNA-AFLP分析,獲得了與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)的特異基因片段,并對(duì)這些基因的功能進(jìn)行了研究。利用256對(duì)引物組合進(jìn)行了選擇性擴(kuò)增,共得到差異條帶1987條,通過(guò)回收、克隆獲得了其中497條目的片段,并對(duì)其進(jìn)行了序列測(cè)定。通過(guò)BlastX同源性分析與

4、Blast2go軟件相結(jié)合,對(duì)目的基因進(jìn)行了更準(zhǔn)確的功能鑒定。
　　 BlastX同源性檢索分析表明,254條具有高度同源蛋白。其中,功能未知的基因51條,其它目的基因的同源蛋白有肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)、F-box蛋白家族、類Tubby蛋白(TLP)、生長(zhǎng)素水解酶、細(xì)胞色素P450、油菜素內(nèi)酯受體、及細(xì)胞分裂素氧化酶等與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白以及各類轉(zhuǎn)錄因子、代謝途徑關(guān)鍵酶、熱激蛋白等。另外,有80條差異表達(dá)基因在GenBan

5、k數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到相似序列。
　　 Blast2go軟件的分析結(jié)果表明:132個(gè)沒(méi)有相似序列的目的片段,可能是新基因；其余365個(gè)有同源蛋白的目的基因可按功能分為50類。目的基因可能參與的反應(yīng)主要有乙醛酸代謝、淀粉代謝及蔗糖代謝等代謝途徑；生長(zhǎng)素、葉綠醌及泛醌等的生物合成過(guò)程；對(duì)光刺激、溫度刺激及氧化等的應(yīng)激反應(yīng)；細(xì)胞定位；光合作用；跨膜運(yùn)輸及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。
　　 (3)從利用cDNA-AFLP技術(shù)分離得到的差異片段中選擇性