花椰菜胚性愈傷組織cDNA-AFLP分析及EF-1α和LEC1 cDNA克隆.pdf

1、通過(guò)體細(xì)胞胚胎途徑再生苗可以快速繁殖種苗，為遺傳變異、基因工程提供良好受體環(huán)境。本試驗(yàn)建立了花椰菜植株再生技術(shù)體系，利用cDNA-AFLP技術(shù)，對(duì)花椰菜松散型胚性愈傷組織和緊密型胚性愈傷組織差異基因進(jìn)行分析，克隆了花椰菜胚性愈傷組織 EF-1α、LEC1基因，以期為體細(xì)胞胚胎分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、花椰菜體胚發(fā)生植株再生的研究
　　本試驗(yàn)以‘臺(tái)灣慶農(nóng)65天’種子為材料，研究不同濃度的2,4-D和N

2、AA對(duì)花椰菜胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并篩選出花椰菜胚性愈傷組織最佳增殖培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基。結(jié)果得出：以5d苗齡子葉、切成不帶葉脈方塊于MS+0.5mg/L2,4-D+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的胚性愈傷組織率最高，達(dá)97.3%，最佳增殖培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L2,4-D+3%蔗糖+0.6%瓊脂，最佳體胚成熟培養(yǎng)基：1/2MS+0.1 mg·L-1IBA，誘導(dǎo)體胚萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L

3、6-BA+0.5 mg·L-1IAA，達(dá)32.6%。
　　2、利用cDNA-AFLP技術(shù)分析花椰菜胚性愈傷組織差異表達(dá)基因
　　以花椰菜松散型胚性愈傷組織和緊密型胚性愈傷組織為材料，利用cDNA-AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)體胚發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行了差異表達(dá)分析。對(duì) cDNA-AFLP技術(shù)中選擇性擴(kuò)體系進(jìn)行優(yōu)化，獲得了20μL最佳選擴(kuò)體系：模板cDNA為30ng、dNTP為300μmol/L、引物為0.5μmol/L、Ex taq酶0.5

4、U、10×Buffer為2μL。
　　利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，結(jié)果獲得了43條陽(yáng)性TDFs，與其他物種相關(guān)基因同源性較高，功能分別涉及細(xì)胞增殖、能量代謝、翻譯因子、逆境響應(yīng)、基因沉默、酶催化調(diào)控，激素應(yīng)答，抗氧化還原等方面。
　　3、花椰菜胚性愈傷組織EF-1α的克隆
　　從 cDNA-AFLP分析中獲得 EF-1α片段，利用 RACE技術(shù)克隆花椰菜胚性愈傷組織EF-1αcDNA，全長(zhǎng)1705b

5、p（登錄號(hào)為 KC508634），共編碼449個(gè)氨基酸，與油菜（FJ529180.1）、擬南芥（NM10066613）、薔薇（JN399225.1）、煙草（D63396.1）、荔枝（DQ471426.1）的同源性分別為95%、91%、89%、88%、87%。通過(guò)生物信息學(xué)分析，推測(cè)花椰菜胚性愈傷組織 EF-1α編碼的蛋白為穩(wěn)定、親水性、非分泌蛋白。其編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由22.72%α螺旋、31.40%β-折疊和45.88%的不規(guī)則卷

6、曲組成，三維結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β-折疊為主，有少量的不規(guī)則卷曲，與參考蛋白序列對(duì)比一致性為74.21%。
　　4、花椰菜胚性愈傷組織的LEC1的克隆
　　利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從花椰菜緊密型胚性愈傷組織中克隆了LEC1 cDNA，該cDNA全長(zhǎng)926bp（登錄號(hào)為KC541558），編碼239個(gè)氨基酸，與油菜（EU371726.1）、擬南芥（NM102046.4）、龍眼（GU584089.2）、玉米（NM00111