東南景天鎘超積累相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、超積累生態(tài)型東南景天是在中國(guó)本土發(fā)現(xiàn)的Zn/Cd超積累植物，是植物修復(fù)的良好材料。本研究利用cDNA-AFLP技術(shù)分析了超積累生態(tài)型東南景天鎘耐性或積累相關(guān)的基因；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析了兩個(gè)光合作用相關(guān)基因與鎘耐性或積累的關(guān)系；同時(shí)利用RACE技術(shù)分離得到了三個(gè)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)子，并利用酵母功能互補(bǔ)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)研究了三個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)子的功能。主要結(jié)果如下：
　　 1、利用cDNA-AFLP技術(shù)(cDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

2、：cDNA-amplified fragmentlength polymorphism)分析比較了超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天在鎘處理下的基因表達(dá)差異。采用水培條件，超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天的鎘處理濃度分別為100μM和2μM；處理時(shí)間為24小時(shí)和8天，不加鎘處理的植物作為對(duì)照；通過cDNA-AFLP分析，從超積累生態(tài)型東南景天中分離得到了58個(gè)與非超積累生態(tài)型東南景天有差異的基因片段。分離得到的基因片段與GenBa

3、nk數(shù)據(jù)庫(kù)里TDFs(transcript-derived fragments)進(jìn)行同源性比對(duì)，其中31個(gè)TDFs與功能已知的基因有顯著的同源性；6個(gè)TDFs與功能未知的基因有明顯的同源性；其余21個(gè)TDFs與數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因沒有明顯的同源性。31個(gè)與功能已知的基因有顯著同源性的TDFs按照功能可以分為脅迫響應(yīng)、細(xì)胞代謝和組成、光合作用相關(guān)、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)、表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子和蛋白結(jié)合7大類。另外，在這些分離得到的58個(gè)TDFs中，有37個(gè)基因

4、片段在鎘處理下表達(dá)量是下調(diào)的，其余21個(gè)基因片段在鎘處理下表達(dá)量是上調(diào)的。
　　 2、本試驗(yàn)采用水培條件，測(cè)定了鎘對(duì)兩種生態(tài)型東南景天的葉綠素?zé)晒鈪?shù)和PsbS基因表達(dá)水平的影響，同時(shí)分析了超積累生態(tài)型東南景天的PsbS基因(SaPsbS)與鎘耐性、積累的關(guān)系。結(jié)果表明，2μM鎘處理8天后，非超積累生態(tài)型東南景天的Fv/Fm值和NPQ值顯著降低；超積累生態(tài)型東南景天的Fv/Fm值沒有發(fā)生變化，NPQ值顯著增加；此外，兩種生態(tài)型東

5、南景天的PsbS(photosystemⅡ subunit S)基因的表達(dá)量都上調(diào)了2倍左右。超表達(dá)超積累生態(tài)型東南景天的PsbS(SaPsbS)基因能夠顯著促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)；在100μM鎘處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因煙草的生物量比野生型煙草的高出7％-28％，而且轉(zhuǎn)基因煙草的NPQ值顯著高于野生型煙草；超表達(dá)SaPsbS能夠顯著增加煙草地上部的鎘積累量。
　　 3、本試驗(yàn)采用水培條件，分析了鋅/鎘處理對(duì)兩種生態(tài)型東南景天的Lhcb2基因表

6、達(dá)水平的影響，并進(jìn)一步研究了超積累生態(tài)型東南景天的Lhcb2(SaLhcb2)基因與鎘積累和耐性的關(guān)系。結(jié)果表明，不同濃度的鋅(50，500，2000μM)、鎘(2.20.200μM)處理顯著增加了兩種生態(tài)型東南景天的Lhcb2基因的表達(dá)量。在短時(shí)間處理(24小時(shí))下，超積累生態(tài)型東南景天的基因上調(diào)倍數(shù)大于非超積累生態(tài)型植物；而在長(zhǎng)時(shí)間處理?xiàng)l件下，非超積累生態(tài)型植物的基因上調(diào)倍數(shù)要大于超積累生態(tài)型的。超表達(dá)超積累生態(tài)型植物的Lhcb2(

7、SaLhcb2)基因能夠顯著促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，在不加鎘條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的地上部生物量比野生型煙草的生物量高出14％-41％，根系的生物量可以高出21％-57％；在加鎘處理下，轉(zhuǎn)基因煙草的地上部生物量也是高于野生型煙草。此外，有四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系地上部的鎘積累量比野生型的高出6％-35％，說明超表達(dá)SaLhcb2能夠促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)以及煙草對(duì)鎘的積累量。
　　 4、P1B-type ATPases(HMs，heavy metal ATP

8、ases)屬于P-type ATPases，是一類具有轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)子，其中的HMA2、HMA3和HMA4具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅、鎘、鉛的功能。根據(jù)不同物種間的序列同源性設(shè)計(jì)兼并引物，并利用RACE技術(shù)分離得到了超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天的HMA2基因(分別命名為SaHMA2和SnHMA2)。利用洋蔥表皮細(xì)胞分析基因亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明，SaHMA2和SnHMA2基因是細(xì)胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)子。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SaHMA2能夠增

9、強(qiáng)鋅/鎘突變體△zrc1對(duì)鋅、鎘的耐性，而且SaHMA2轉(zhuǎn)運(yùn)鋅、鎘的能力顯著大于SnHMA2；表達(dá)SaHMA2或SnHMA2的酵母的鋅、鎘含量顯著低于表達(dá)空載體的酵母。在植物體內(nèi)，超積累生態(tài)型東南景天根系的HMA2基因表達(dá)量是非超積累植物的5倍，地上部HMA2基因的表達(dá)量是非超積累植物的13倍。超積累生態(tài)型東南景天根系的HMA2在添加鋅、鎘處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)，而非超積累生態(tài)型根系的基因表達(dá)量在添加鎘處理時(shí)下調(diào)，添加鋅處理時(shí)上調(diào)。此外，轉(zhuǎn)基

10、因結(jié)果表明，超表達(dá)SaHMA2后煙草地上部的鎘和鋅含量都是野生型的1.6倍，根系的鎘含量和鋅含量是野生型的66％和44％；超表達(dá)SnHMA2的煙草根系的鎘含量顯著低于野生型的，但是地上部的鎘/鋅含量沒有顯著增加。以上結(jié)果表明，SaHMA2基因的鋅/鎘轉(zhuǎn)運(yùn)能力大于SnHMA2基因，而且SaHMA2基因的表達(dá)量顯著高于SnHMA2，SaHMA2基因應(yīng)該是超積累生態(tài)型東南景天能夠高效地往地上部轉(zhuǎn)運(yùn)鋅/鎘的主要原因之一。
　　 5、金屬

11、耐性蛋白(Metal tolerance protein，MTP1)是CDF(cation diffusionfacilitator)家族的重要成員，是液泡膜上負(fù)責(zé)往液泡中轉(zhuǎn)運(yùn)Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)子。本試驗(yàn)利用RACE技術(shù)從超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天中分離得到了兩個(gè)編碼金屬耐性蛋白的基因(MTP1)，命名為SaMTP1和SnMTP1。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SaMTP1和SnMTP1能夠增強(qiáng)△zrc1酵母突變體對(duì)鋅的耐性，而且SaMT

12、P1和SnMTP1的轉(zhuǎn)運(yùn)能力基本相同?；騺喖?xì)胞定位的結(jié)果表明，SaMTP1和SnMTP1是分布在植物細(xì)胞液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)子。在植物體內(nèi)，超積累生態(tài)型東南景天地上部的MTP1基因的表達(dá)量是非超積累生態(tài)型的88倍左右，根系的基因表達(dá)量是非超積累植物的10倍。在添加鋅處理時(shí)，超積累生態(tài)型植物地上部的基因表達(dá)量上調(diào)了1倍，根系的基因表達(dá)量沒有顯著性變化；而非超積累生態(tài)型植物根系的MTP1基因表達(dá)量上調(diào)了1倍，地上部的基因表達(dá)量沒有顯著變化。在添

13、加鎘處理時(shí)，超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型植物地上部的基因表達(dá)量都有下調(diào)。轉(zhuǎn)基因植物的分析結(jié)果表明，超表達(dá)SaMTP1或SnMTP1能夠顯著增加煙草根系和地上部的的鋅含量，轉(zhuǎn)基因植物SaM2(超表達(dá)SaMTP1)和SnM1(超表達(dá)SnMTP1)根系的鋅含量分別是野生型煙草的3.4倍和2.6倍；而地上部的鋅含量分別是野生型的1.5倍和1.4倍。本研究的結(jié)果表明，SaMTP1基因應(yīng)該是超積累生態(tài)型東南景天耐受和積累鋅的重要基因之一。
　

14、　 6、CAXs是Ca2+/cation反向轉(zhuǎn)運(yùn)子，AtCAX2和AtCAX4具有轉(zhuǎn)運(yùn)鎘離子的能力，負(fù)責(zé)將Cd轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入液泡。本試驗(yàn)還從兩種超積累生態(tài)型和非超積累東南景天中分離得到了編碼CAX2轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因，分別命名為SaCAX2和SnCAX2，兩個(gè)基因編碼的蛋白的氨基酸序列有96％的同源性。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明SaCAX2和SnCAX2都能夠轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子，而且SaCAX2的轉(zhuǎn)運(yùn)能力要低于SnCAX2。在植物體內(nèi)，兩種生態(tài)型東南景天

15、的CAX2基因的表達(dá)量在對(duì)照情況下沒有顯著性差異，而兩個(gè)基因?qū)n/Cd的響應(yīng)卻不一樣。對(duì)于超積累生態(tài)型植物，根系的基因表達(dá)量在Zn/Cd處理時(shí)都有所下調(diào)，地上部的表達(dá)量在添加鎘處理時(shí)上調(diào)而在添加鋅處理時(shí)下調(diào)。對(duì)于非超積累生態(tài)型東南景天，地上部和根系的基因表達(dá)量在添加鋅處理時(shí)都沒有顯著性差異；而在添加鎘處理時(shí)，根系的基因表達(dá)量上調(diào)而地上部的表達(dá)量是下調(diào)的。轉(zhuǎn)基因植物的分析結(jié)果表明，超表達(dá)SaCAX2(SaC9)或SnCAX2(SnC7)