玉米外源抗蟲基因轉(zhuǎn)化體創(chuàng)制與表達(dá)分析.pdf

1、玉米是世界上最重要的糧食作物之一，蟲害是造成玉米產(chǎn)量損失的主要原因。傳統(tǒng)育種耗時長、效率低，轉(zhuǎn)抗蟲基因玉米成為解決蟲害的最有效途徑之一。本研究根據(jù)植物偏愛密碼子原則，對野生型蘇云金芽孢桿菌Cry1F進(jìn)行人工改造，并在5'端前面加上了AdhI的增強子序列。為了初步驗證其對玉米螟等害蟲的毒性，我們將人工改造后的基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體中PET28b中，繼而將載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳顯示原

2、核表達(dá)誘導(dǎo)出來的殺蟲蛋白主要以包涵體的形式存在。免疫試紙條顯示Cry1F可溶蛋白的存在。收集原核表達(dá)誘導(dǎo)的可溶性蛋白，加入到人工制成的玉米螟飼料中，喂食玉米螟，進(jìn)行原核表達(dá)蟲試實驗。蟲試實驗證明，改造后的Cry1F顯示出很強的殺蟲能力，說明Cry1F基因人工改造正確。
　　改造正確后的Cry1F進(jìn)一步構(gòu)建到植物表達(dá)載體CPB中，該載體以組成型啟動子CaMV35S驅(qū)動目的基因，抗除草劑Bar基因作為選擇標(biāo)記基因。采用基因槍介導(dǎo)法遺傳

3、轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織，經(jīng)過組織培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因植株。然后對得到的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定。PCR初步篩選出陽性植株，隨機選取4株P(guān)CR呈陽性的植株進(jìn)行Southern分子雜交，證明外源基因整合到玉米基因組中。用Cry1F免疫試紙條對PCR呈陽性的植株進(jìn)行檢測，試紙條呈陽性，說明轉(zhuǎn)基因玉米植株能夠表達(dá)出相應(yīng)的殺蟲蛋白。對表達(dá)Cry1F殺蟲蛋白的植株進(jìn)行室內(nèi)抗蟲實驗，證明轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強的抗蟲性。
　　本實驗將人工改造后的Cry1F基因，