轉抗蟲基因107楊和巨霸楊外源基因表達研究.pdf

1、隨著基因工程的發(fā)展，將某些生物中的抗性基因轉化到目的林木基因組中，從而改良林木性狀，提高林木的品質，已得到廣泛應用。為了明確多基因轉化載體中的基因互作及載體結構對外源基因表達穩(wěn)定性和高效性的影響。本文選取轉Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因和Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107楊各三個轉基因株系，以及含有BtCry1Ac-BtCry3A基因，但表達框結構不同的轉基因巨霸楊各四個轉基因株系為試驗對象，研究了各轉基因株系外源基

2、因的穩(wěn)定性、Bt毒蛋白的時空變化及轉基因對107楊光合的影響，同時確定了一個轉基因株系的外源基因在基因組中的插入位置。主要研究結果如下:
　　1.通過PCR檢測表明，各轉基因株系均能擴增出一條與含有目的基因的陽性質粒大小相同的條帶。說明轉Cry1Ac-Cry A-NTHK1、和Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107楊各3個轉化株系中三個目的基因均穩(wěn)定存在，含有BtCry1Ac-BtCry3A基因的兩種基因轉化載體所轉化的8個

3、轉基因巨霸楊株系也均檢測到目的基因的穩(wěn)定存在。
　　2.通過熒光定量PCR檢測，在轉錄水平對各個外源基因的表達進行檢測。結果表明，Cry1Ac基因的轉錄豐度較低，轉錄豐度大小在2.9×103～7.2×104之間，Cry3A基因的轉錄豐度較高，為4.1×105～5.6×107。可見，外源基因可以在107楊和巨霸楊mRNA水平上正常表達。轉基因107楊和轉基因巨霸楊中，Cry3A基因轉錄豐度均明顯高于Cry1Ac基因的轉錄豐度。

4、>　　3.利用ELISA技術檢測了各轉基因株系不同月份枝條上部葉片Bt毒蛋白含量變化規(guī)律及8月份枝條上部、中部和下部三個部位葉片、韌皮部和木質部的Bt毒蛋白含量，分別進行比較，結果表明Cry1Ac和Cry3A毒蛋白表達量在各株系之間存在顯著差異，各株系Cry3A毒蛋白含量均極顯著高于Cry1Ac毒蛋白含量，后者表達量極低。各載體在不同月份Cry1Ac毒蛋白表達量規(guī)律為:p1和p2載體的各轉基因株系均在8月份達到頂峰，p1載體的毒蛋白表達

5、量大于p2，p3和p4載體各轉基因株系均在9月份達到頂峰，p4載體的毒蛋白表達量大于p3。Cry3A毒蛋白表達量均在8月份表達最高。各載體株系6、7月份毒蛋白的表達量上升比較緩慢，8、9月份其表達量急劇上升，而后呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。8月份枝條上部、中部和下部三個不同部位葉片、韌皮部和木質部的Bt毒蛋白含量測定結果未表現(xiàn)出一致性。
　　4.對轉基因各株系的光合指標進行比較，分析全天各轉基因株系的凈光合速率、蒸騰速率均值和胞間二氧化碳

6、濃度差異性得出，各轉基因株系的各項光合生理指標與對照相比，數(shù)值雖大小不同，但大部分株系均顯著高于對照或與對照無顯著差異，這說明外源基因的導入沒有影響植株的光合能力。
　　5.采用Tail-PCR技術對轉基因株系進行外源基因插入位置檢測，經(jīng)過測序分析證明，轉Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107楊2號株系外源基因位于受體植物基因組第14條染色體上。同時發(fā)現(xiàn)外源基因的插入使F-box蛋白結構域受到影響。比對插入位點兩側堿基序列