南林895楊轉(zhuǎn)抗旱耐鹽基因研究.pdf

1、楊樹(shù)在我國(guó)分布廣泛，生長(zhǎng)較快，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖容易，并且其基因組小，在傳統(tǒng)和分子操作上要比大多數(shù)樹(shù)種簡(jiǎn)單，是林木育種研究的模式樹(shù)種。DREBlC轉(zhuǎn)錄因子(Dehydration Responsive：Element Binding)是一類與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠識(shí)別與干旱、高鹽及低溫等脅迫應(yīng)答相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域中的 DIE(dehydration responsiveelement)順式作用元件并與之結(jié)合，從而啟動(dòng)下游抗逆基因的表

2、達(dá)，提高植物的抗逆性。開(kāi)展楊樹(shù)抗干旱耐鹽堿轉(zhuǎn)DREBlC基因研究對(duì)于我國(guó)干旱、鹽堿地區(qū)的造林綠化、擴(kuò)大楊樹(shù)的栽培區(qū)、改善生態(tài)環(huán)境等方面均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究以南林895楊 (美洲黑楊I(lǐng)-69×歐美楊I(lǐng)-45雜種F1中選育出的優(yōu)良無(wú)性系)為受體材料，采用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREBlC基因；同時(shí)，同源克隆擬南芥逆境脅迫誘導(dǎo)性啟動(dòng)子 rd29A，構(gòu)建植物表達(dá)載體p

3、DI2-rd29A 并轉(zhuǎn)化楊樹(shù)，主要試驗(yàn)結(jié)果如下： 1．根據(jù)NCBI上報(bào)道的rd29A啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，從擬南芥中同源克隆rd29A啟動(dòng)子，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBrd，并轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行活性驗(yàn)證。轉(zhuǎn)基因煙草的GUS組織化學(xué)染色及PCR分析結(jié)果表明，在低溫、干旱及高鹽等脅迫誘導(dǎo)下，rd29A啟動(dòng)子可增強(qiáng)GUS基因表達(dá)，表明rd29A啟動(dòng)子可應(yīng)用于植物抗逆基因工程研究。 2．構(gòu)建由逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A啟動(dòng)目的基因DRE

4、BlC表達(dá)的植物表達(dá)載體pDR2-rd29A，雙酶切鑒定結(jié)果表明，rd29A啟動(dòng)子成功地插入載體pDR2 中；采用液氮凍融法將載體 pDR2-rd29A 導(dǎo)入農(nóng)桿菌LB4404中，菌液PCR擴(kuò)增出目的條帶，證明該植物表達(dá)載體pDR2-rd29A 已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LB4404中。 3．進(jìn)行選擇性抗生素潮霉素的敏感性試驗(yàn)，分別對(duì)葉片分化及生根本底濃度進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，3mg/L 潮霉素(Hyg)可作為芽再生的臨界篩選濃度；1.5

5、mg/L Hyg可作為芽生根的篩選濃度。 4．用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將由兩種啟動(dòng)子(組成型啟動(dòng)子35S 和逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A)啟動(dòng)的目的基因DREBlC 導(dǎo)入南林895楊中。經(jīng)過(guò)潮霉素篩選，得到潮霉素抗性的轉(zhuǎn)35S::DREBlC 基因的楊樹(shù)80株，轉(zhuǎn)rd29A::DREBlC 基因的楊樹(shù)40株?？剐灾仓甑腜CR與實(shí)時(shí)定量PCR分子檢測(cè)結(jié)果，轉(zhuǎn)35S::DREBlC基因楊樹(shù)有30株呈陽(yáng)性，轉(zhuǎn)rd29A::DREBlC 基因楊