高效抗蟲多基因轉化載體構建及其在煙草中表達驗證.pdf

1、利用多基因共表達策略將多種不同性狀目的基因轉入植物，以提高植物的綜合抗逆能力是目前轉基因技術應用重要領域之一。本研究構建通過攜帶NotⅠ/Bsp120Ⅰ同尾酶的植物轉化載體和攜帶SpeⅠ/XbaⅠ/NheⅠ同尾酶克隆載體，利用同尾酶連接后原有酶切位點消失原理，可不斷在植物轉化載體中連入新的已知功能的Bt抗蟲基因cry1Ac、cry3A和選擇標記gus基因。同時通過在植物轉化載體中增加MAR結構，載體中更換不同啟動子、在啟動子后加入增強子

2、序列及調換連入外源基因ORF的順序等方法，對多基因植物轉化載體系統(tǒng)進行改進，構建出系列植物轉化載體，采用農(nóng)桿菌介導法轉入煙草中進行表達驗證，以期實現(xiàn)多外源基因穩(wěn)定與高效表達。主要研究結果如下:
　　1.以pCAMBIA1302為基礎表達載體構建了植物表達載體p1780，該載體含有來源于pCAMBIA1302的nptⅡ抗性選擇標記（另引入獨立的NOS終止子），克隆位點兩側分別添加了保證外源基因穩(wěn)定轉錄表達的煙草MAR序列及同尾酶系統(tǒng)

3、的酶切位點Bsp120Ⅰ和SpeⅠ;以pBI121為基礎克隆載體構建了克隆載體p699(35S)，該載體含有35S啟動子和位于35S啟動子下游的擬南芥AtADH5'-UTR翻譯增強子序列;通過對p699替換啟動子，改造成分別含有Coymv和FMV啟動子的克隆載體p820(coy)和p820(FMV);三個克隆載體克隆位點均為NotⅠ和XbaⅠ/NheⅠ同尾酶酶切位點;所構建的植物表達載體p1780和克隆載體p699/p820，可利用同尾

4、酶技術選用合適的雙酶切(NotⅠ/Bsp120Ⅰ和SpeⅠ/XbaⅠ/NheⅠ)構建含有一個和（或）多個外源基因的植物表達載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)可方便對同一表達載體引入不同外源目的基因及實現(xiàn)不同基因的排列組合。
　　2.利用上述載體系統(tǒng)，成功構建了8個具有已知功能目的cry1Ac基因和cry3A基因及gus報告基因不同組合的植物轉化載體:p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac、p1780-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、

5、p1780-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-Coy∷cry3A-FMV∷gus-35S∷cry1Ac、p1780-FMV∷gus-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A。
　　3.將不同植物轉化載體搖菌形成侵染菌液，

6、設置Kan抗生素和Cef抗生素各11個濃度梯度，確定轉基因過程中分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的Kan最適濃度分別為50mg/L和75mg/L，Cef最適濃度分別為300mg/L和600mg/L，在此濃度條件下可很好抑制農(nóng)桿菌生長且形成良好煙草分化植株;將不同轉化載體利用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草，經(jīng)分化、生根成苗、再分化、溫室及蔭棚訓化、大田移栽等步驟，每個不同轉化載體獲得13～30株系不等，最終共獲得155個株系612棵陽性煙草成苗。
　　

7、4.經(jīng)gus組織化學染色初步篩選，6個含有gus基因的轉化載體所獲煙草轉基因植株均獲得陽性染色結果;進一步用nptⅡ抗性標記基因、gus基因、cry1Ac和cry3A目的抗蟲基因各自的特異性引物進行轉化煙草植株的PCR擴增檢測，所有具相應外源基因的轉基因煙草株系均可獲得陽性擴增結果，證明轉化載體所含外源基因已與煙草基因組整合。
　　5.采用QRT-PCR對每個轉化載體轉化的陽性煙草中隨機選取的10個株系進行gus、cry1Ac和c

8、ry3A基因轉錄檢測，不同株系相應目的基因轉錄豐度介于103～107之間，表明轉化載體所攜帶外源基因可在煙草體內成功轉錄，同一轉化載體獲得不同株系、不同外源基因排列組合的目的基因間轉錄豐度無顯著性差異。
　　6.采用ELISA試劑盒對相應的轉基因株系Cry1Ac和Cry3A蛋白進行檢測，Cry1Ac蛋白表達量介于0.45～11.61μg/g之間，Cry3A蛋白表達量介于0.78～6.73μg/g之間，表明外源Bt基因可在轉基因煙草

9、植株體內表達相應蛋白。不同轉化載體之間蛋白表達存在差異，同一轉化載體不同株系之間也存在差異。
　　7.對轉基因煙草植株進行室內飼蟲試驗，表明外源Bt毒蛋白具有較高殺蟲活性，其中含有cry1Ac基因的4個轉化載體轉化的所有株系、含有cry3A基因的2個轉化載體轉化的所有株系分別對棉鈴蟲和茄二十八星瓢蟲一齡幼蟲在飼喂第1d致死率達到100％，其余含不同Bt基因的轉基因株系對棉鈴蟲和茄二十八星瓢蟲幼蟲致死效果表現(xiàn)慢效性，一般在第6d或第

10、7d達到100％;不同轉化載體所攜帶Bt基因毒蛋白表達與相應蟲試結果高度相關。
　　8.所構建植物轉化載體具有較好應用前景，用于其他植物材料進行轉化防治棉鈴蟲時推薦優(yōu)先使用p1780-FMV∷gus-35S∷cry1A、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A;用于防治茄二十八星瓢