TNP-LPS和TNP-KLH誘導(dǎo)的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)抗體分泌細胞的分化研究.pdf

1、虹鱒作為硬骨魚,代表了免疫系統(tǒng)進化史上的一個重要的階段,對其免疫系統(tǒng)的研究具有重要的意義。針對三硝基苯基.脂多糖(TNP-LPS,TL,T細胞非依賴性1型抗原),三硝基苯基.匙孔血藍蛋白(TNP-KLH,TK,T細胞依賴性抗原)以及三硝基苯基-匙孔血藍蛋白-脂多糖(TNP-KLH-LPS,TKL,嵌合抗原)免疫的虹鱒,對免疫后虹鱒的血液,脾臟和腎臟中的不同發(fā)育階段的抗原誘導(dǎo)的B細胞進行了為期兩年的監(jiān)測。分析了ex vivo抗體分泌細胞,

2、漿細胞,in vitro抗原可誘導(dǎo)B細胞的組織分布及動態(tài)變化。同時,虹鱒是世界上廣泛養(yǎng)殖的重要冷水魚,現(xiàn)在鮭鱒類養(yǎng)殖用的疫苗主要是革蘭氏陰性細菌苗,保護性免疫通常是菌苗和佐劑一起使用。但是這種疫苗劑型會影響其經(jīng)濟價值。若要制備更有效的對魚體無損害的疫苗,就必須明了其免疫系統(tǒng)的作用機制。本文通過比較這三種抗原的在細胞水平上的免疫效果,為設(shè)計更為行之有效的水產(chǎn)疫苗奠定基礎(chǔ)。對免疫后的四組虹鱒(TL,TK,TKL,對照)在第0,6,16,25

3、,35,44周取血,每組每次取3至10條,運用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對抗體效價和抗體親和力進行分析?？贵w效價結(jié)果表明,TL和TKL抗原的抗體反應(yīng)均在16周至25周之間出現(xiàn)峰值。TL和TKL顯示了快速而激烈的初次免疫應(yīng)答。TK抗原的初次應(yīng)答較為遲緩平穩(wěn)。TKL較TL反應(yīng)更快更高一些,顯示了嵌合抗原的優(yōu)勢。對親和力的研究顯示,這三種抗原均呈現(xiàn)出不同程度的親和力成熟。TK和TKL組與TL組相比具有較高的親和力,TKL的親和力最高,親和

4、力成熟亦最為顯著,再次表明了嵌合抗原優(yōu)于TL和TK。
　　 在免疫后的第0,6,16和44周解剖魚體,每組每次3至4條,分別取血,脾臟,前腎和后腎4種組織,收集組織中的淋巴細胞進行ex vivo和in vitro培養(yǎng),用細胞周期抑制劑羥基脲(HU)在in vitro培養(yǎng)過程中來區(qū)分漿母細胞(HU抑制其細胞周期)和漿細胞。淋巴細胞的in vitro可誘導(dǎo)能力是由在in vitro培養(yǎng)過程中加入特定濃度的TL抗原來誘導(dǎo)淋巴細胞來確定

5、的。而后采用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)定量組織中的抗體分泌細胞,觀察抗體分泌細胞(漿細胞和漿母細胞)在各種組織中的分布情況。從ELISPOT結(jié)果來看,大量漿細胞(約85％)存在于虹鱒的前腎(相當于哺乳動物的骨髓),而在血液,脾臟和后腎的均有較少的分布。漿母細胞和可誘導(dǎo)淋巴細胞(未成熟淋巴細胞和免疫記憶細胞)主要分布于外周血淋巴(72％)中,,在脾臟(14％)和前腎(16％)中的分布極少。對ex vivo的ELISPOT分析證明,

6、自發(fā)的抗體分泌細胞主要存在于前腎中(86％)。后腎中可分離出來的白細胞數(shù)量很少,所以從總體來看其所含有的漿細胞,漿母細胞和可誘導(dǎo)淋巴細胞都比較少。針對三種不同的抗原,漿母細胞和漿細胞以及未成熟淋巴細胞和記憶細胞的組織分布情況大致相同。就其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體分泌細胞的數(shù)量而言,TKL顯示出了極大的優(yōu)勢,TK也同樣產(chǎn)生了很好的免疫反應(yīng)和免疫記憶。TL免疫后的白細胞,抗原誘導(dǎo)的in vitro反應(yīng),血細胞和脾細胞呈現(xiàn)出50到100倍的增加,而前腎

7、中的白細胞僅增加了10倍。TD免疫后的白細胞,in vitro培養(yǎng)抗原誘導(dǎo)后,血細胞和脾細胞呈現(xiàn)出500倍的增加,而前腎中的白細胞僅增加了30倍。
　　 第46周分別用TL和TK抗原二次免疫TL組和TK組來分析TI-1抗原和TD抗原在硬骨魚的產(chǎn)生免疫性記憶的能力。二次免疫后,分別在第16和46周取血,脾臟和前腎每組每次4尾,從抗體效價,抗體親和力以及產(chǎn)生抗體分泌細胞的數(shù)量來看,這兩種抗原均可使魚體產(chǎn)生免疫性記憶。這與哺乳動物的只

8、有對TD抗原才能產(chǎn)生免疫記憶的現(xiàn)象不同,虹鱒對TI-1抗原的二次免疫應(yīng)答要比TD抗原更快更激烈。
　　 對不同時間點收集的淋巴細胞進行HU定時(每24hr添加1次)添加實驗,來分析B細胞在硬骨魚主要免疫組織(血液,脾臟和前腎)中的的增殖分化情況。它可以確定三種細胞的量:1)處于分裂增殖狀態(tài)的抗體分泌細胞(如漿母細胞),2)誘導(dǎo)的可以過渡到早期漿細胞的漿母細胞(由HU敏感變?yōu)镠U不敏感),3)穩(wěn)定的漿細胞(HU不敏感)。結(jié)果表明,

9、不管是在初次免疫后還是二次免疫后,血液中自細胞的in vitro反應(yīng)僅是由漿母細胞組成。而脾臟中,in vitro誘導(dǎo)的漿母細胞則可以分化為短壽漿細胞。與之相反的,免疫后16周前腎擁有一定數(shù)量的漿細胞。在前腎淋巴細胞的in vitro培養(yǎng)中添加TL抗原和HU對其幾乎沒有影響,它們在培養(yǎng)的初始就已經(jīng)出現(xiàn),并且一直存在于培養(yǎng)的過程中。這表明前腎中的大部分B淋巴細胞為B細胞分化的最終階段即漿細胞。
　　 運用流式細胞儀分析各時間點包括