致斷奶仔豬腹瀉和豬水腫病大腸桿菌O141株及O8株基因突變株LpxLLpxMLpxP的構(gòu)建及其免疫效力研究.pdf

1、斷奶仔豬腹瀉和豬水腫病是由產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)引起的一種常見(jiàn)且重要的細(xì)菌性傳染病，易與其它病原菌、病毒并發(fā)或繼發(fā)感染，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。引起斷奶仔豬腹瀉和豬水腫病的大腸桿菌國(guó)外報(bào)道的血清型主要有O139、O138、O141、O8、O157、O45等。
　　 STEC是革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁中含有脂質(zhì)雙分子層。細(xì)胞壁的內(nèi)膜主要

2、由磷脂構(gòu)成而外壁層主要由磷脂和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)構(gòu)成。LPS由類(lèi)脂A、核心多糖和O-特異性多糖三部分組成。類(lèi)脂A中長(zhǎng)脂肪鏈的緊密疊加以及LPS的疏水部共同形成了細(xì)菌的通透性屏障。類(lèi)脂A在革蘭氏陰性菌的致病性方面起重要作用。它可以激活體內(nèi)的內(nèi)在免疫系統(tǒng)，使陽(yáng)離子抗菌肽、細(xì)胞因子、凝固因子以及其他免疫刺激因子的合成增多。類(lèi)脂A包含四條(R)-3-hydroxyacy主鏈，其中某些(R)-3-hydroxy

3、acy鏈可以進(jìn)一步乙?；揎?。LpxL和LpxM在大腸桿菌類(lèi)脂A分子生物合成的最后一步中起重要作用，這一步發(fā)生于細(xì)菌細(xì)胞壁的內(nèi)壁層。在正常溫度下，細(xì)菌在酰基合成轉(zhuǎn)移酶的作用下將月桂酰和肉豆蔻酰連續(xù)不斷地添加到四?；a(chǎn)物中間體上。但是，在12℃低溫環(huán)境時(shí)，?；铣赊D(zhuǎn)移酶LpxP代替LpxL發(fā)揮作用，從而使鏈結(jié)合軟脂酮。LpxL和LpxM基因的突變使細(xì)菌的致病力及對(duì)吞噬細(xì)胞的抵抗力均降低。
　　 本研究運(yùn)用等位基因交換的方法構(gòu)建Lp

4、xL的單基因突變株和LpxLLpxM雙基因缺失突變株以及LpxLLpxMLpxP三重突變株。PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的LpxL、LpxM和LpxP基因片段并將其插入到pMD18-Tsimple載體中相應(yīng)酶切位點(diǎn)處，再運(yùn)用分子克隆的方法將Cam抗性基因分別插入到目的基因LpxL、LpxM和LpxP中，構(gòu)建出帶Cam抗性基因標(biāo)志的載體pT-LpxL-Cam、pT-LpxM-Cam和pT-LpxP-Cam。PCR擴(kuò)增片段LpxL-Cam、Lpx

5、M-Cam和LpxP-Cam，并電轉(zhuǎn)化入帶有質(zhì)粒pKD46的豬病原性大腸桿菌分離株O141和O8中，在Red重組系統(tǒng)中質(zhì)粒pKD46表達(dá)的重組酶的幫助下，篩選出O141及O8株的基因突變株O141△LpxL△LpxM△LpxP、O8△Lpx△LpxM△Lpx，并在pCP20的作用下去除Cam抗性。
　　 Southernblot結(jié)果顯示FRT位點(diǎn)基因在STECO141及O8株的基因組中的插入是單拷貝的;RT-PCR結(jié)果表明突變株

6、的LpxL、LpxM和LpxP基因不能轉(zhuǎn)錄，而其上下游基因的轉(zhuǎn)錄未受到影響。體外生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定結(jié)果表明O14△LpxL△LpxM△LpxP、O8△LpxL△LpxM△LpxP突變株的生長(zhǎng)速率與野生株相比明顯減慢。
　　 本研究制備了基因缺失株的滅活菌，并對(duì)其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)體液免疫及其對(duì)強(qiáng)毒株攻擊后的免疫保護(hù)力等方面進(jìn)行了研究，為PWD和ED基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。將已構(gòu)建的基因缺失株的菌株制成抗原，經(jīng)滅活后制成油乳劑疫苗免