大腸桿菌EHEC O157：H7突變株的構(gòu)建和新預(yù)測TTSS分子伴侶基因的克隆表達(dá).pdf

1、腸出血性大腸桿菌0157：H7是引起人腹瀉，出血性結(jié)腸炎以及溶血性尿毒綜合癥的病原菌，它主要通過TTSS將毒力因子分泌到宿主細(xì)胞中致病。目前在EHEC O157：H7中已經(jīng)鑒定的TTSS效應(yīng)蛋白主要有5個，與其它病原菌相比少了很多，而且目前鑒定的5個效應(yīng)蛋白作用也無法解釋EHEC 0157：H7所導(dǎo)致的復(fù)雜的病理反應(yīng)。為了深入研究EHEC 0157：H7的致病機(jī)理，我們首先從所有病原菌基因數(shù)據(jù)庫中提取有關(guān)TTSS序列數(shù)據(jù)，同時進(jìn)行摸體分

2、析、同源分析以及基因定位分析，預(yù)測出4個EHEC O157：H7可能的新分子伴侶，我們擬對EHEC O157：H7中預(yù)測的4個新分子伴侶進(jìn)行類別鑒定，并進(jìn)一步開展新分子伴侶的結(jié)構(gòu)與功能方面的研究。 λRed 體內(nèi)重組技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種基于同源重組原理在細(xì)菌染色體上直接修飾各類DNA分子的新技術(shù)，可以在原核生物中實現(xiàn)精確、快速的基因敲除和敲入，較之傳統(tǒng)的酶切、連接、轉(zhuǎn)化的方案更快速方便，而且應(yīng)用范圍更廣泛，是基因工程技術(shù)的

3、重要補(bǔ)充。 本論文利用了λRed體內(nèi)重組技術(shù)，其主要技術(shù)路線是利用設(shè)計引物通過PCR的方法合成外源線形DNA，該引物由40-至50-nt的被敲除基因的同源區(qū)以及20nt的含F(xiàn)RT位點的質(zhì)粒抗性基因同源區(qū)組成。將合成的外源DNA電轉(zhuǎn)化至已經(jīng)獲得了pKD46并且經(jīng)過阿拉伯糖誘導(dǎo)的宿主菌EHEC O157：H7中，這樣外源DNA片段就會在pKD46的作用下，替代EHEC O157：H7染色體上的分子伴侶基因。最后通過FLP位點特異性重

4、組酶將外源線形DNA分子上抗性基因去除。利用該方法成功的敲除了新預(yù)測的4個分子伴侶基因中的2個，并通過PCR鑒定，DNA測序證實了實現(xiàn)了精確敲除。 在通過利用λRed 體內(nèi)重組技術(shù)將分子伴侶進(jìn)行基因敲除，構(gòu)建了相應(yīng)的EHEC O157：H7缺失突變體以后，我們將野生型EHEC O157：H7和2個缺失突變體進(jìn)行培養(yǎng)，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測它們的胞外分泌蛋白的差異，找到了不同的差異蛋白，對差異蛋白進(jìn)行了初步分析。