腸出血型大腸埃希菌O157：H7 Tir基因的克隆表達及其免疫保護研究.pdf

1、一、研究背景和目的： 腸出血型大腸埃希菌（enterohaemorrhagic E.coli，EHEC）O157：H7是一種新型腸道致病菌，能引起人出血性腸炎（hemorrhagic colitis，HC）、溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）和血栓性血小板減少性紫癜（thrombotic thromobocytopenie porpura，TTP）等。 EHEC O157：H

2、7感染呈暴發(fā)流行趨勢，具有高度的致病性與致死性，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。目前，尚缺乏有效的防治方法，使用抗生素治療可促使大腸埃希菌O157：H7釋放致死性志賀毒素（Shiga toxin，Stx），加劇患者并發(fā)HUS的危險性?？梢姡兄瞥霭踩⒂行У囊呙鐚︻A(yù)防EHEC O157：H7感染具有重要意義。迄今為止，尚無成功的疫苗用于臨床。 EHEC O157：H7的毒力因子主要有轉(zhuǎn)位緊密黏附素受體（translocation i

3、ntimin receptor，Tir）、緊密黏附素（Intimin），志賀毒素1型、2型（Stx1、Stx2）和溶血素（Haemolysin，Hly）等。轉(zhuǎn)位緊密黏附素受體（Tir）經(jīng)細菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)位進入宿主細胞并定位于細胞膜上，與緊密黏附素結(jié)合后，可引起宿主細胞多聚肌動蛋白聚合，造成黏附局部微絨毛刷狀緣破壞，形成特征性的黏附和抹平損傷（attaching and effacing lesion，A/E lesion）。因此，阻斷

4、緊密黏附素與Tir的結(jié)合，可避免黏附和擦拭性損傷的發(fā)生，在感染的黏附階段予以拮抗。 本研究從NCBI網(wǎng)站GenBank上查到EHEC O157：H7標準株EDL933轉(zhuǎn)位緊密黏附素受體完整的編碼區(qū)（cds）基因序列（Accession number NC002655.2）和氨基酸序列（protein id NP290261.1）。利用生物信息學(xué)在線工具和軟件，預(yù)測分析其蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性，判斷能否作為疫苗候選抗原；設(shè)計特異性引物

5、，擴增Tir編碼基因；將PCR產(chǎn)物克隆到pET-30a（+）載體上，獲得重組原核表達質(zhì)粒[pET-30a（+）-tir]；轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21/DE3，誘導(dǎo)表達和純化重組蛋白Tir；將重組蛋白Tir免疫小鼠，檢測血清和糞便提取物中抗體效價，對重組蛋白Tir的動物免疫保護作用進行了初步研究。 二、研究方法： 1. EHEC O157：H7 Tir基因的生物信息學(xué)分析 從NCBI網(wǎng)站GenBank上查到EHEC

6、O157：H7標準株EDL933 Tir完整的編碼區(qū)基因序列和氨基酸序列。運用在線網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器蛋白分析專家系統(tǒng)Expasy（http：//ca.expasy.org/）所提供的蛋白組學(xué)和序列分析工具，預(yù)測Tir的理化性質(zhì)，如分子量、等電點、一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)等；利用服務(wù)器http：//www.cbs.dtu.dk，使用Phobius工具預(yù)測Tir的跨膜螺旋所在區(qū)域；使用B細胞表位在線分析軟件（http：//tools.immuneepit

7、ope.org/tools）預(yù)測蛋白質(zhì)的B細胞表位。 2. EHEC O157：H7 Tir基因的克隆、表達和鑒定 2.1 Tir基因的擴增和克隆 根據(jù)目的基因的ORF和原核表達質(zhì)粒PET-30a（+）酶切位點，設(shè)計2條引物，PCR擴增tir基因，限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和空質(zhì)粒PET-30a（+），T4連接酶連接。用PCR、雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒。 2.2 Tir基因的表達、純化

8、和鑒定 將重組質(zhì)粒PET-30a（+）-tir轉(zhuǎn)化至BL21/DE3中，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)下表達重組蛋白Tir，用12% SDS-PAGE鑒定，用親和層析純化蛋白。抗6×His單克隆抗體稀釋液為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG稀釋液為二抗，通過Western Blotting方法，鑒定重組蛋白的免疫反應(yīng)性。 23動物免疫和EHEC O157：H7 Tir基因的抗體效價測定 重組

9、蛋白Tir與弗氏完全佐劑（第二、三次用弗氏不完全佐劑）或霍亂毒素B亞單位（Cholera toxin B subunit，CTB）混合后，通過皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠，對照組用PBS免疫，每間隔2周加強免疫一次。免疫前及免疫3次后10d每組隨機抽10只小鼠，從小鼠眼眶采集血清和收集糞便，間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價和糞便提取物中抗體效價。 3.小鼠攻毒實驗 末次免疫20 d后，以EHEC O157：H7活菌進行

10、動物攻毒實驗，小鼠于攻毒前禁食、禁水12 h，每只小鼠經(jīng)食道灌注1×1010CFU/ml EHEC O157：H7活菌0.3ml，同時腹腔注射絲裂霉素（2.5 mg/ml）。攻毒后12 h恢復(fù)飲食飲水，并記錄動物死亡情況。15d后，存活的小鼠處死剖檢，病理切片觀察。 三、結(jié)果： 1. EHEC O157：H7 Tir基因的生物信息學(xué)分析 tir基因全長1，677bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼

11、558個氨基酸。理論相對分子質(zhì)量和等電點分別是58022.4Da和5.01。在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，蛋白質(zhì)總體親水性高。InterProScan分析該氨基酸序列含有三個結(jié)構(gòu)和功能域，即Tir的N端、C端和與Intimin結(jié)合的M區(qū)。Sec（secondary structure）預(yù)測α螺旋（H）、β折疊（E）和無規(guī)卷曲（L）的比例分別是22.76：17.38：59.86，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主。Phobius預(yù)測結(jié)果顯示，Tir蛋白有2段跨膜

12、結(jié)構(gòu)，2個肽段在細胞質(zhì)內(nèi)，1個肽段在細胞膜外。Bepipred分析預(yù)測有20個B細胞線性表位肽段。 2. EHEC O157：H7 Tir基因的克隆、表達和鑒定 用設(shè)計合成的引物擴增出tir基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，大小為1，677bp，與預(yù)期一致。重組質(zhì)粒pET-30a（+）-tir經(jīng)NdeⅠ和xhoⅠ雙酶切和測序鑒定，證實構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下表達重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示與理論預(yù)測的融合

13、蛋白分子量相符，親和層析純化后獲得目的蛋白Tir。 Western Blotting鑒定結(jié)果顯示，空載體pET-30a（+）誘導(dǎo)表達產(chǎn)物不與抗6×His單克隆抗體反應(yīng)，而純化的融合蛋白和pET-30a（+）-tir重組菌株IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物在60kD左右處均出現(xiàn)1條特異條帶，證明目的蛋白融合了6×His標簽，大小與預(yù)測的融合蛋白分子量相符。 3. EHEC O157：H7 Tir抗體效價測定 皮下免疫和鼻腔免疫后

14、，小鼠血清中均能檢測到高滴度的IgG類抗體；皮下免疫組的血清滴度達到6400，鼻腔免疫組為3200；鼻腔免疫組血清獲得的IgA類抗體滴度為6400，明顯高于皮下免疫組（200）。鼻腔免疫組糞便提取物sIgA類抗體滴度為16，也高于皮下免疫組（4）。 4.動物攻毒實驗 在15d觀察期內(nèi)，皮下對照組和鼻腔對照組死亡7只，存活7只，存活率為50%。皮下免疫組死亡5只，存活9只，存活率為64.3%（9/14）。鼻腔免疫組死亡1只

15、，存活13只，存活率為92.9%（13/14）。 經(jīng)X2檢驗分析，鼻腔免疫組與其對照組有顯著性差異（P=0.033）；皮下免疫組與其對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.704）。 四、結(jié)論： 擴增的tir基因大小為1，677bp，為完整的編碼區(qū)基因序列，編碼蛋白Tir相對分子質(zhì)量和等電點分別是58022.4Da和5.01，在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，蛋白質(zhì)總體親水性較高，含有2段跨膜結(jié)構(gòu)和3個功能域。預(yù)測結(jié)果顯示，Tir毒力因子是

16、很有潛力的疫苗候選抗原。 成功構(gòu)建了pET-30a（+）-tir原核表達載體，細菌培養(yǎng)物經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達出重組融合蛋白，純化得到重組融合蛋白，分子量大小為60KD左右。 重組蛋白通過皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠后，均可刺激小鼠產(chǎn)生特異性IgG和IgA類抗體，在糞便提取物中也能檢測到IgA類抗體。皮下免疫組的血清IgG類抗體滴度高于鼻腔免疫組；鼻腔免疫組獲得的IgA類抗體滴度明顯高于皮下免疫組；鼻腔免疫組糞便提取物IgA類