腸出血型大腸埃希菌O157∶H7 espF基因缺陷突變株的構建及其特性初步研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 腸出血型大腸埃希菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一種新現腸道致病菌,能引起人出血性腸炎(Hemorrhagic colitis,HC)、溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(Thrombotic thromobocytopenie porpura,TTP)等。
　

2、　 EHEC屬于產志賀毒素型大腸埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,SVEC),在STEC的O血清型中,0157:H7型是爆發(fā)流行常見的血清型,在多個國家都有流行。1993年,美國發(fā)生了一次EHEC 0157:H7暴發(fā),涉及到4個州,700余名兒童受感染,其中51例發(fā)生了HUS,4例死亡。1996年,日本發(fā)生了一起EHEC 0157:H7暴發(fā)流行,涉及30多個縣市,患者9000余名,死

3、亡9人。1999-2000年,我國蘇皖等地發(fā)生EHEC 0157:H7大規(guī)模暴發(fā)流行,患者約2萬人,發(fā)生急性腎功能衰竭者195人,死亡177人,這次爆發(fā)是迄今為止世界上流行規(guī)模最大、死亡人數最多、流行時間最長、發(fā)病因為最復雜的一次。目前,EHEC 0157:H7的感染呈暴發(fā)流行趨勢,具有較強的致病性與致死性,已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。
　　 EHEC O157:H7感染引起的典型病理特征是腸上皮細胞黏附抹去(attaching

4、and effacing,A/E)損傷,其主要病理學變化表現為細菌與腸上皮細胞緊密黏附,細菌黏附部位的腸上皮細胞骨架發(fā)生改變,腸微絨毛肌動蛋白發(fā)生去聚化,從而導致微絨毛收縮和脫落。已證實,EHEC和腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicEscherichia coli,EPEC)的主要毒力因子是指包括引起A/E損傷的所有基因,位于染色體腸細胞脫落位點LEE(the locus of enterocyte effacement

5、,LEE)致病島。espF基因位于LEE第4個操縱子。序列分析表明,不同致病菌中表達的EspF蛋白在核苷酸和氨基酸序列上有差別。EHEC和EPEC的espF基因序列同源性為91％,氨基酸序列同源性為75％,從N端起最初的70個氨基酸同源性為99％,C末端氨基酸最大的區(qū)別是EspF在EHEC中有4個脯氨酸重復子,EPEC中有3個。目前,EspF功能的研究多集中于EPEC。它的功能主要有破壞腸上皮細胞的屏障功能,靶向作用于線粒體,啟動宿主細

6、胞早期凋亡程序,誘導細胞死亡。
　　 近幾年,盡管對EPEC中的EspF蛋白功能進行了深入研究,并證實腸屏障的破壞與EspF密切相關,但EspF其他的功能,如誘導細胞死亡、參與AME損傷的機制仍不清楚,與宿主相關蛋白相結合導致信號變化也只是推測。espF基因在EHEC和EPEC中高度同源,但編碼的蛋白有差異,并且EPEC和EHEC的黏附部位不同,EPEC黏附于小腸的腸上皮細胞,EHEC黏附于大腸的腸上皮細胞。這說明了EHEC和E

7、PEC對宿主細胞的致病分子機理存在差異。那么,在EHEC 0157:H7中,EspF是否影響細菌的黏附性、參與細胞屏障的破壞以及誘導細胞死亡呢?根據espF基因在EPEC中的研究進展,本研究從EspF的N端功能區(qū)分子結構入手,采用重疊延伸OL-PCR(overlap extension PCR,OL-PCR)、同源重組等方法構建EHEC O157:H7 EspF的N端部分序列缺失突變株,并用突變株與野生株分別感染細胞,對其功能比較研究,

8、可望揭示EspF蛋白在EHEC O157:H7感染導致腸上皮細胞產生黏附-抹去損傷中的作用。
　　 二、研究方法
　　 1.EHEC O157:H7Nal(△espF)突變株的構建 將菌株EHEC O157:H7廣州株(菌號:246)接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),不斷增加萘啶酮酸(Nal)濃度,至Nal終濃度為50μg/ml,誘導出具有萘啶酮酸抗性菌株,命名為EHECO157:H7(Nal)。根據GenBank的espF基

9、因序列(Accession NO.NC_002655)及其上、下游的DNA序列,設計合成兩對引物:P1、P2和P3、P4,其中P2和P3的5’端有19bp互補序列,P1、P4分別添加酶切位點XbaI和SacI。以EHECO157:H7全基因組為模板,采用重疊延伸PCR(OL-PcR)法,通過兩步PCR獲得espF缺陷同源性片段△espF。△espF克隆于pMDT19,構建重組質粒pMDT19-△espF。pMDT19-△espF和自殺質

10、粒pCVD442同時進行雙酶切,將目的片段連接到pCVD442,構建重組自殺質粒pCVD442-△espF。后者電穿孔轉化于大腸埃希菌SM10,得到重組菌SM10(pCVD442-△espF)。菌株EHEC O157:H7(Nal)與重組菌SM10(pCVD442-△espF)混合,通過濾膜進行接合轉移,并用氨芐青霉素和萘啶酮酸進行雙抗篩選菌株EHEC O157:H7(pCVD442-△espF),該菌株稀釋后涂布于濃度為5～10％的蔗

11、糖平板上,篩選突變株EHEC O157:H7(△espF)。
　　 2.野生株與突變株生物學特征比較 野生株和突變株按革蘭染色步驟進行染色,光學顯微鏡觀察。在相同培養(yǎng)條件下,在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h分別測野生株和突變株的OD600,以時間為橫坐標,OD600的對數為縱坐標繪制各生長曲線。
　　 3.細菌黏附實驗
　　 (1)吉姆薩(Giemsa)染色觀察細菌黏附 Lo

12、vo細胞進行載玻片爬片后,細菌感染作用于細胞2h,按吉姆薩染色試劑說明進行染色,待干,鏡檢。
　　 (2)涂板計算細菌黏附率過夜培養(yǎng)的野生株、突變株和工程菌DH5 α(陰性對照菌株)重懸于不含抗生素的培養(yǎng)基(DMEM,10％胎牛血清)。Lovo細胞培養(yǎng)于12孔板內,長至單層細胞,約為2X 105cells/孔。以每孔2x107的細菌量接種到培養(yǎng)Lovo細胞的12孔板內(使細胞感染倍數約為100),輕輕晃動培養(yǎng)板混勻。細胞培養(yǎng)板放

13、入培養(yǎng)箱,37℃,5％CO2,1.5-2h。每種細菌接種8個復孔。黏附實驗步驟參照先前實驗研究所述。為計算黏附于細胞的細菌數,細胞用PBS洗3次,加入150μl的0.5％Triton X-100裂解細胞,孵育8min后,加入100μl PBS,反復吹打吸出樣品,每孔樣品做梯度稀釋后涂布于2個瓊脂平板計數菌落數。計算黏附率(黏附率=黏附到細胞的細菌數/初始加到細胞孔的總細菌數×1000‰)。利用SPSS13.0進行單因素方差分析,比較各菌

14、黏附率的平均值差異。
　　 4.統(tǒng)計分析處理方法 細菌黏附實驗中采用單因素方差分析(One WayANOVA),比較各菌株黏附率的差異。
　　 三、結果
　　 1.構建了突變株EHEC O157:H7(△espF)OL-PCR擴增出了espF基因缺陷同源性片段△espF,大小約為1762bp,測序并與原espF基因序列比對,片段△espF缺失了162bp。利用萘啶酮酸和氨芐青霉素雙抗性獲得了菌株EHECO157:

15、H7(pCVD442-△espF),取該菌株的菌液為模板,P1、P4引物PCR擴增可見有兩條片段,大小分別為1924bp和1762bp。菌株EHEC O157:H7(pCVD442-△espF)經過蔗糖篩選,獲得同源重組菌株EHEC O157:H7(△espt；),菌液PCR驗證,可見到一條片段,大小約為1762bp。測序證實,菌株EHEC O157:HT(△espF)的espF基因缺失162bp。
　　 2.野生株和突變株的生

16、物學性狀 在革蘭染色中,野生株和突變株均為革蘭染色陰性,短小棒狀桿菌。根據所測的OD600繪制生長曲線,野生株和突變株的生長曲線趨勢基本一致。
　　 3.細菌黏附實驗 吉姆薩染色可見野生株黏附于細胞的數量較多,突變株較少。涂板菌落計算細菌的黏附率,單因素方差分析結果顯示,菌株間的黏附率比較.P<0.001,具有統(tǒng)計學意義。野生株的平均黏附率是18.128±3.159‰,突變株的平均黏附率是6.756±1.297‰。
　　

17、 四、結論
　　 1.選擇EHEC O157:H7廣州株(菌號:246)作為始發(fā)株,采用OL-PCR擴增出espF基因缺陷同源性片段△espF,與espF原基因序列相比,前者缺失了162bp堿基,缺失的位置位于EHEC OP157:H7全基因組中的4659104-4659265,位于EspF蛋白氨基酸序列中的N端第15-68個氨基酸殘基,因此,本研究破壞了EspF蛋白N端的功能區(qū)。
　　 2.利用自殺性質粒pCVD442