λRed重組和CRISPR-Cas9技術(shù)在構(gòu)建禽病原性大腸桿菌ahpF、yfgC基因突變株中的運用.pdf

1、大腸桿菌是溫血動物包括人在內(nèi)的腸道中的正常菌群之一，大部分為非致病性菌株，少數(shù)則具有致病性。致病性大腸桿菌可分為腸道致病性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌(ExPEC)兩大類，禽致病性大腸桿菌（avian pathogenic E.coli，APEC）屬于ExPEC的成員，定植于腸道外，可以引發(fā)禽的局部感染或全身感染性疾病-大腸桿菌病。禽大腸桿菌病已成為最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。已發(fā)現(xiàn)APEC擁有多種致病

2、因子，并且還有新的致病因子在不斷地被發(fā)現(xiàn)被研究。基因突變是研究基因功能的重要技術(shù)手段。
　　抗氧化防御系統(tǒng)是細(xì)菌保護(hù)自身免受代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物損傷的一種保護(hù)性機制，ahpF基因就是抗氧化防御系統(tǒng)中的一員，它與ahpC一起作用將內(nèi)源性H2O2催化成相應(yīng)的醇和H2O，從而清除代謝過程中產(chǎn)生的H2O2，以減少對細(xì)菌自身的傷害。另一個研究的基因yfgC和細(xì)菌的外膜蛋白保持著緊密的聯(lián)系，它可以降解錯誤折疊的外膜蛋白，對細(xì)菌外膜蛋白的完

3、整性起到重要的作用。但是目前來說，它的具體作用機制尚不清楚。本研究旨在研究ahpF、yfgC基因與APEC致病性之間的關(guān)系，為揭示APEC的致病機理及進(jìn)一步構(gòu)建APEC弱毒疫苗株奠定基礎(chǔ)。
　　運用λRed重組系統(tǒng)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3、E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2、E058ΔyfgC-3基因缺失突變株，同時將帶有相應(yīng)啟動子的ahp

4、F、yfgC基因完整閱讀框插入低拷貝載體pACYC184中，通過電轉(zhuǎn)化突變株來篩選獲取回復(fù)株。RT-PCR結(jié)果表明E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3、E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2基因均不能轉(zhuǎn)錄，而其上下游基因的轉(zhuǎn)錄不受影響，E058ΔyfgC-3發(fā)生了意外轉(zhuǎn)錄。
　　半數(shù)致死量試驗結(jié)果表明，與野生株相比，E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2、E058ΔyfgC-3突變

5、株的致病力顯著降低，而E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3突變株致弱不明顯。35日齡SPF雞體內(nèi)定居與持續(xù)試驗結(jié)果表明，E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2、E058ΔyfgC-3突變株在各臟器的定居與持續(xù)能力均顯著低于野生株E058。生長曲線的測定結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中，各突變株生長速度與野生株相似，并未表現(xiàn)出明顯差異，但在加入H2O2培養(yǎng)基中，E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-

6、2、E058ΔyfgC-3突變株的生長速度顯著低于野生株，而E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3突變株生長速度反而快于野生株的生長速度。血清殺菌試驗顯示各突變株和野生株沒有表現(xiàn)出顯著差異。體外競爭試驗結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中，均表現(xiàn)為輕度致弱。這些結(jié)果表明，yfgC與APEC E058菌株的致病性高度相關(guān)，而ahpF不影響APEC的致病性。而用兩種方法突變的突變株，從致病性來看，有細(xì)微的差別，但不是很明