禽病原性大腸桿菌E058株iucA、iucAiutA基因及sit與aerobactin操縱子基因突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的一種常見的局部或全身性感染的細(xì)菌性傳染病，且易與其它病原性細(xì)菌、病毒并發(fā)或混合感染。目前，該病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌病，給世界范圍內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 病原性大腸桿菌天然形成了特定利用鐵元素的攝取系統(tǒng)(specific iron assimilation system)，這一系統(tǒng)由氣桿菌素(a

2、erobactin)的合成以及氣桿菌素特定的外膜蛋白受體（由iutA編碼）兩部分組成。Williams最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了這一系統(tǒng)，細(xì)菌的這兩種成分在鐵含量很少的情況下，均能被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)表達(dá)。Lafont等研究表明，氣桿菌素合成的相關(guān)基因只存在于有毒力的菌株，在無毒力菌株中并沒有發(fā)現(xiàn)。編碼氣桿菌素的5個(gè)基因，共處于一個(gè)操縱子，位于ColⅤ這一大質(zhì)粒上，其中參與氣桿菌素合成的是iucA、iucB、iucC和iucD4個(gè)基因，而iutA編

3、碼一種膜蛋白受體。本研究旨在探討編碼氣桿菌素的iucA、iutA基因以及aerobactin和sit操縱子與APEC致病性間的關(guān)系，了解APECiucA、iutA以及aerobactin和sit操縱子基因突變株的生物學(xué)特性，為了解APEC的致病機(jī)理和特異性防治措施奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究運(yùn)用同源重組的方法構(gòu)建了E058△iucA、E058△iucA△iutA及E058△vir基因缺失突變株，其中vir包括sit及aerobact

4、in操縱子的15kb大小的片段。同時(shí)將含iucA完整閱讀框的質(zhì)粒pGEX-6P-1-iucA電轉(zhuǎn)化突變株E058△iucA，從而篩選獲得回復(fù)株Re-E058△iucA。PCR擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的iucA基因并插入到pBSK載體的多克隆位點(diǎn)中，然后運(yùn)用分子克隆方法將Zeocin抗性基因插入到目的基因iucA中，構(gòu)建出帶Zeocin抗性基因的質(zhì)粒pS-iucA-Zeo。PCR擴(kuò)增片段iucA-Zeo，并電轉(zhuǎn)化入帶有質(zhì)粒pKD46的禽病原性大腸桿

5、菌分離株E058中，運(yùn)用同源重組的方法，篩選出基因突變株E058△iucA，將片段iutA-Kan電轉(zhuǎn)化入帶有質(zhì)粒pKD46的單突變株E058△iucA中，篩選出雙突變株E058△iucA△iutA。以質(zhì)粒pUC4K為模板，PCR擴(kuò)增片段，電轉(zhuǎn)化帶有質(zhì)粒pKD46的E058菌株中，運(yùn)用同源重組的方法，篩選出基因突變株E058△vir。
　　 Southernblot結(jié)果表明Zeocin、Kanamycin抗性基因在APECE05

6、8突變株質(zhì)粒中的插入是單拷貝的;RT-PCR結(jié)果表明iucA、iutA基因的缺失只影響其本身的表達(dá)，而未影響其上下游基因的表達(dá)。Aerobactinproduction試驗(yàn)結(jié)果顯示突變株E058△iucA、E058△iucA△iutA、E058△vir不能產(chǎn)生aerobactin，而野生株E058、回復(fù)株Re-E058△iucA都可以產(chǎn)生aerobactin。生長曲線的測定結(jié)果顯示突變株E058△iucA、E058△iucA△iutA、

7、E058△vir和親本株E058在生長速度上沒有顯著差異;E058、E058△iucA、E058△iucA△iutA及E058△vir株的半數(shù)致死量(LD50)分別為104.4、105.0、104.8和105.0CFU;雞巨噬細(xì)胞HD-11吞噬試驗(yàn)結(jié)果表明突變株與親本株的侵襲能力沒有顯著差異;體外競爭結(jié)果顯示，突變株較E058株輕度致弱;體內(nèi)競爭實(shí)驗(yàn)表明，與野生株E058相比，突變株E058△iucA、E058△iucA△iutA毒力高

8、度致弱;動態(tài)分布試驗(yàn)結(jié)果表明，突變株E058△iucA在心血中含菌量是12CFU.ml-1(p＜0.001)，肝臟含菌量6.3×102CFU.g-1(p＜0.001)，脾臟含菌量7.1×103CFU.g-1(p＜0.01)，肺臟含菌量7.8×103CFU.g-1(p＜0.001)，腎臟含菌9.4×102CFU.g-1(p＜0.001)，E058△iucA△iutA心血帶菌量15CFU.ml-1(p＜0.001)，肝臟含菌量94CFU.g

9、-1(p＜0.001)，脾臟含菌量9.1×102CFU.g-1(p＜0.001)，肺臟含菌量3.6×103CFU.g-1(p＜0.001)，腎臟含菌量1.4×102CFU.g-1(p＜0.001)，E058△vir心血帶菌量15CFU.ml-1(p＜0.001)，肝臟含菌量1.05×102CFU.g-1(p＜0.001)，脾臟含菌量3.2×103CFU.g-1(p＜0.001)，肺臟含菌量6.8×103CFU.g-1(p＜0.001)，