禽病原性大腸桿菌E058株chp基因突變株的構(gòu)建及其致病性與1993至2006年分離株耐藥性的研究.pdf

1、禽大腸桿菌病(avianc olibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。禽大腸桿菌病是2至12周齡雞和火雞的一種常見傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的

2、經(jīng)濟損失。大腸桿菌血清型復(fù)雜多樣，在禽類中最常見的血清型是O1、O2和O78，與其致病相關(guān)的毒力因子已被相繼報道，如脂多糖復(fù)合物、莢膜、黏附素、溫度敏感性血凝素、鐵攝取系統(tǒng)、外膜蛋白、毒素、AGI-3基因組島、侵襲素IbeA、Pst系統(tǒng)、大腸桿菌素等。 人們在致力于弄清APEC已知毒力因子的同時，也將注意力轉(zhuǎn)移到新的致病基因的分離與鑒定方面。我們在大量禽源大腸桿菌的致病性實驗中，發(fā)現(xiàn)有相當比例的分離株并不具備已知的毒力因子，這說

3、明這些分離株還存在其他新的毒力因子。尋找和發(fā)現(xiàn)新的大腸桿菌致病因子，探討其致病機理，具有重要的研究意義。 1.禽病原性大腸桿菌E058株chp基因突變株的構(gòu)建及其致病性研究本研究以構(gòu)建基因突變株的方法，初步鑒定了APEC可能毒力相關(guān)片斷aes-31的功能，同時結(jié)合其生物學(xué)特性，為研究該病的致病機理和防制措施奠定了基礎(chǔ)。 采用抑制差減雜交技術(shù)對禽病原性大腸桿菌高致病菌株E058(血清型O2)與低致病菌株E526進行基因組差

4、異片段克隆與分析后檢出的32個特異性差異片段中選取aes-3l進行進一步的研究，該片段在基因芯片雜交試驗中也表現(xiàn)為E058株在體外培養(yǎng)的上調(diào)基因。推測aes-3l片斷很可能與APEC對禽的致病力相關(guān)。本研究運用基因重組的方法構(gòu)建了aes-3l的基因等位突變株。經(jīng)blast搜索，片斷aes-3l包含兩個開放閱讀框，chp1和chp2，均編碼保守假定蛋白。PCR擴增chp1和chp2基因并將其分別插入到pBSK載體的多克隆位點中，再運用基因

5、重組的方法將博來霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因分別插入到兩個目的基因chp1和chp2中，構(gòu)建出帶博來霉素抗性基因標志的載體pBSK-chp1-Zeo和帶卡那霉素抗性基因標志的pBSK-chp2-Kan，通過PCR分別擴增片段chpl-Zeo和ehp2-Kan，并電轉(zhuǎn)化入禽病原性大腸桿菌分離株E058中，根據(jù)同源重組原理，篩選出E058突變株E058(△chp1)和E058(△chp2)；將片斷chp1-Zeo電轉(zhuǎn)化到E058突變株E0

6、58(△chp2)中，再篩選出E058雙突變株E058(△chp1△chp2)。生長曲線測定的結(jié)果顯示在LB液體培養(yǎng)基中突變株在對數(shù)生長期的生長速度均低于親本株E058。 E058，E058(△chp1)，E058(△chp2)和E058(△chp1△chp2）株的半數(shù)致死量(LD50)分別為104.5CFU，104.8 CFU.105.1 CFU和105.4 CFU。1日齡雛雞攻毒實驗結(jié)果表明E058(△chp1)、E058(△chp

7、2)、E058(△chp1 △chp2)攻毒后血液和各臟器中的的細菌清除率均高于E058株，尤其是雙突變株E058(△chp1/△chp2)細菌清除率顯著高于親本株E058。攻毒48 h后大腸桿菌病病變比較中可以看出，各個突變株引起大腸桿菌病變的程度有了一定下降。因此，可以初步認定特異性差異片斷aes-31在禽大腸桿菌E058的致病和持續(xù)感染的過程中起到了一定的作用。 2.1993至2006年禽病原性大腸桿菌分離株的耐藥性研究從

8、我國江蘇等20個省、市、自治區(qū)臨診上具有典型大腸桿菌病病變的病、死家禽中分離到大腸桿菌1351株中隨機挑選出不同時期、不同血清型的的分離株203株，按NCCLs推薦的紙片擴散法測定了其對21種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果表明，分離株對強力霉素和四環(huán)素的耐藥率最高，均為98％，其余依次為磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素、氨芐西林，耐藥率在74％-84％之間，對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、呋喃妥因、呋喃

9、唑酮的耐藥率為11％-51％，壯觀霉素、頭孢哌酮、頭孢噻呋的耐藥率分別為6％、2％和1％，對多黏菌素B無一例耐藥，對本來不敏感的青霉素和林可霉素依舊保持高度耐藥。以3-4 年為一個時間段，將分離株分為四個時期， 1993-1995年58株，1996-1999年42株，2000-2003年39株，2004-2006年64株?？梢钥闯?，禽病原性大腸桿菌對各種藥物的耐藥性普遍呈現(xiàn)上升的趨勢，表現(xiàn)最為明顯是喹諾酮類藥物，其次是磺胺類。在2000