腸外致病性大腸桿菌基因缺失突變株ΔhmuU,ΔhmuV,ΔhmuU-ΔhmuV的構(gòu)建.pdf

1、大腸桿菌（Escherichiacoli，E.eoli）是一類在自然界中存在范圍廣，血清型復(fù)雜，致病性多樣的重要的人畜共患病原菌。根據(jù)遺傳和致病特點，可將大腸桿菌分為以下3種類群:共生菌群，致腹瀉型菌群和腸外致病性菌群。腸外致病性大腸桿菌(ExtraintestinalPathogenicEscherichiacoli，ExPEC)是指一群能在腸道中定殖不引起腹瀉但能引起腸外組織感染的一類大腸桿菌。ExPEC因其特異性的毒力因子而引起人

2、和動物特定的疾病，包括:人新生兒腦膜炎，泌尿道感染，豬的肺炎、腎炎、腦膜炎、敗血癥等，禽的氣囊炎、滑膜炎、腹膜炎、敗血癥等。
　　 鐵是大腸桿菌生存必需的一種重要的營養(yǎng)元素，許多代謝活動都需要鐵的參與。血紅素(heme)是大腸桿菌主要的鐵源之一，heme的攝取能力直接關(guān)系到大腸桿菌在宿主體內(nèi)生存代謝的能力。由heme載體介導(dǎo)的heme攝取途徑是heme的一種重要吸收方式，hmuU基因和hmuV基因是參與該途徑的重要基因，而通過比

3、較本實驗室已經(jīng)測序的5株豬源腸外致病性大腸桿菌強弱毒株間heme攝取系統(tǒng)的差異基因發(fā)現(xiàn)hmuU基因和hmuV基因在強弱毒株間存在差異，推測hmuU基因和hmuV基因可能在大腸桿菌的毒力和致病性方面有功能。因此本研究以大腸桿菌強毒株P(guān)CN033為親本菌，構(gòu)建了3株腸外致病性大腸桿菌PCN033株的基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV，并對其生物學(xué)特性及小鼠毒力進行了研究。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.腸外致

4、病性大腸桿菌PCN033株基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV的構(gòu)建與鑒定
　　 以PCN033株基因組為模板，擴增hmuU基因和hmuV基因的上下游同源臂，擴增產(chǎn)物分別連接到自殺性質(zhì)粒pRE112上構(gòu)建重組質(zhì)粒pREΔhmuU、pREΔhmuV和pREΔhmu。分別將重組自殺性質(zhì)粒pREΔhmuU和pREΔhmuV轉(zhuǎn)化大腸桿菌X7213，與PCN033株進行接合轉(zhuǎn)移，經(jīng)過兩次單交換篩選出單基因缺失突變株

5、ΔhmuU和ΔhmuV。雙基因缺失突變株是在單基因缺失突變株ΔhmuV的基礎(chǔ)上篩選，方法相同。
　　 2.基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV的遺傳穩(wěn)性和生長特性研究
　　 分別將構(gòu)建的基因缺失突變株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，每隔5代進行PCR鑒定，結(jié)果證明基因缺失突變株在20代內(nèi)均能夠穩(wěn)定遺傳。在普通LB培養(yǎng)基（全營養(yǎng)條件）和鐵營養(yǎng)限制條件下測定3株基因缺失株與親本菌株的生長曲線，得出在全營養(yǎng)時

6、3株基因缺失突變株與親本株生長速度相似，在鐵營養(yǎng)限制條件時，3株基因缺失突變株的生長速率低于親本株，其中兩株單基因缺失突變株生長速度較慢，雙基因缺失突變株生長速度最慢。
　　 3.基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV的細(xì)胞粘附與侵入及抗吞噬試驗
　　 腸外致病性大腸桿菌PCN033株基因缺失突變株ΔhmuU、ΔhmuV、ΔhmuU/ΔhmuV和親本菌株分別與PAM細(xì)胞、RAW細(xì)胞和PK15細(xì)胞共培

7、養(yǎng)，并在培養(yǎng)后不同時間用壯觀霉素和氯霉素處理，然后收集細(xì)胞并裂解細(xì)胞，進行細(xì)菌平板計數(shù)，計算細(xì)胞吞噬菌量或侵入菌量。每個樣品重復(fù)四次。對每個時間點3株基因缺失突變株與親本菌株間的吞噬菌量和粘附與侵入菌量進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示3h時，PAM細(xì)胞抗吞噬能力試驗，3株基因缺失突變株與親本菌株差異極顯著(P＜0.01);RAW細(xì)胞抗吞噬能力試驗，3株基因缺失突變株與親本菌株間差異顯著(P＜0.05)。粘附與侵入能力試驗，3株基因缺失突變株的能

8、力比親本株有所減弱，但差異分析不顯著(P＞0.05)。
　　 4.基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV對小鼠的感染試驗
　　 將3種基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV分別用5.0×105CFU、5.0×106CFU、5.0×107CFU三個不同劑量腹腔注射感染各組小鼠，每小組5只小鼠使用一個感染劑量。并設(shè)一組為親本菌株P(guān)CN033對照。感染后連續(xù)觀察1周，記錄各組小鼠死亡

9、情況，根據(jù)寇氏(Korbor)法計算每個菌株的小鼠半數(shù)致死劑量(LD50)。結(jié)果顯示兩株單基因缺失株的LD50值為1.5×106CFU，雙基因缺失株的LD50值為1.5×107CFU，親本菌株的LD50值為9.5×105CFU。與親本菌株相比，單基因缺失突變株毒力下降約2倍，雙基因缺失突變株毒力下降約16倍。
　　 將攻毒后12h內(nèi)死亡的小鼠無菌解剖，分別采集肝，心，脾，肺，腎，腦等組織，稱量，研磨后稀釋涂平板計數(shù)，計算各組織載