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文檔簡介
1、目的:大腸埃希菌是機體正常腸道菌群之一,屬于條件致病菌,主要引起腸道內感染一腹瀉;腸道外感染一多為內源性感染,以尿路感染(urinary tract infection,UTI)最為常見,還有膽囊炎、新生兒腦膜炎、腹膜炎、敗血癥等。引起尿路感染的大腸桿菌,以部分血清群為主,大部分是屬于O血清型,稱之為尿路致病性大腸桿菌(uropathogenic escherichia coli,UPEC)。尿路感染是臨床上最常見的感染性疾病之一,尤其
2、多見于女性,其次是老年人及兒童,并且復發(fā)率高。革蘭陰性及陽性菌均可導致UTI,但是尿路致病性大腸桿菌占了其中的80-90%[1]。UPEC的感染路線是非常明確的:UPEC與共生的大腸桿菌共同定居于腸道——在毒力島編碼的各種活性因子的作用下移行至尿道-膀胱-沿輸尿管上行進入腎臟,大多數感染發(fā)生在下尿路的膀胱(膀胱炎),但是也會發(fā)生上尿路感染。UPEC擁有許多不同的毒力因子,包括Afa/Dr粘附素、Ⅰ型菌毛、細胞毒性壞死因子1、α-溶血素、
3、脂多糖等,這些毒力因子在一定程度上促進了UPEC粘附、侵襲宿主細胞。其中UPEC對尿路上皮細胞的粘附能力是其致病的先決條件,其有助于UPEC附著于尿路上皮避免被尿液沖刷清除[2-3]。近幾年來,發(fā)現有些表面上看來是胞外菌的病原體被證明是胞內條件性致病菌,作為UTI的主要病原菌,UPEC也位列其中[4]。UPEC能夠侵入宿主細胞以及尿道上皮組織,并在其中生存繁殖,這有助于其在宿主體內有效擴散。另外UPEC是生物膜感染的常見病原菌,細菌感染
4、形成生物膜后,可以發(fā)揮協同作用,形成復雜有序的立體結構,逃避免疫系統攻擊,具有較高程度的耐藥性,并可在生物膜解離后播散,導致其他系統的感染[5]。UPEC導致的尿路感染有強烈的復發(fā)傾向,通常發(fā)生在初次急性感染后的幾周或幾個月期間,尿路感染的反復發(fā)作會導致瘢痕腎,還可增加發(fā)生膀胱癌的風險,加之UPEC對多種抗生素的耐藥性,給治療帶來極大的困難,尿路感染的治療已成為臨床亟待解決的難題。揭示新的毒力因子及其在尿路感染過程中的作用是現在的首要任
5、務。聚磷酸鹽激酶1(polyphosphate kinase1,PPK1)是某些細菌體內負責催化ATP脫磷酸殘基形成聚磷酸鹽(polyphosphate,poly P)的一種主要激酶,其主要負責聚磷酸鹽的合成與ATP的代謝[6]。某些ppk1基因缺失的病原菌,其poly P合成量明顯減少,而且存在毒力缺陷,如生物膜形成、捕食能力、對外界不利條件的抵抗力、運動性等均有減弱[7-8]。那么尿路致病性大腸桿菌的ppk1基因缺失,是否會對其致病
6、性產生影響,目前并不清楚,而這也正是本文所要探求的問題。UPEC分離株 CFT073基因組測序已完成,這為我們構建基因缺失株,進一步研究其致病的分子機制提供了可能性。
方法:以尿路致病性大腸桿菌(CFT073)為研究對象,利用 Red同源重組技術敲除CFT073的ppk1基因,構建缺失株△pk1;根據革蘭染色及鏡檢觀察野生株和缺失株的形態(tài),比較野生株、缺失株的菌落形成能力,并分別繪制出野生株、缺失株的生長曲線;以人膀胱癌上皮細
7、胞5637為體外模型,根據菌落數計算細菌的黏附率和侵襲率,比較野生株、缺失株的粘附與侵襲力;體外比較野生株、缺失株在高熱、高滲透壓及酸性環(huán)境壓力條件下,兩者的生存率變化;采用96孔板結晶紫染色法分析CFT073 ppk1基因的缺失對其生物膜形成能力的影響。
結果:⑴以pET28a載體為模板,利用含有同源重組臂的引物通過PCR擴增技術成功構建具有卡那抗性1602bp大小的ppk1基因打靶片段。利用卡那霉素抗性挑選出10個克隆子進
8、行正向篩選和反向驗證。正向篩選結果顯示第1、2號克隆的PCR片段變小,與預期結果一致(1978bp)。判斷這兩個克隆為ppk1基因缺失的菌株。第1,2號克隆的反向驗證擴增無1254bp長度的PCR片段,與預期結果一致,這說明第1、2號克隆在PCR水平被驗證了ppk1基因已經缺失。最后選取第1號克隆的正向篩選PCR產物,用兩側擴增引物進行測序。經序列測序驗證可知第1號克隆為ppk1基因缺失菌株,因為第1號克隆基因組上ppk1基因ORF區(qū)域
9、按設計已完全被卡那抗性基因序列替代,而且CFT073本身的基因組序列在測序范圍內未發(fā)生任何突變,說明成功構建了CFT073 ppk1缺失株△pk1。⑵革蘭染色顯微鏡觀察,野生株和缺失株均為革蘭氏陰性短桿菌,并無差別。兩菌株在LB固體平板培養(yǎng)基上的菌落大小相近,形態(tài)均為乳白色、濕潤、表面光滑的圓形菌落,菌落邊緣整齊,且表面和背面一致。根據所測得的OD600值所繪制的生長曲線,可知野生株和缺失株在營養(yǎng)豐富的LB液體培養(yǎng)基中生長曲線基本一致,
10、這說明ppk1基因的缺失并不影響菌株營養(yǎng)豐富時的生長。但是ppk1基因敲除株△pk1在低營養(yǎng)的MOPS培養(yǎng)液中的生長能力較野生株明顯減弱。⑶經吉姆薩染色后鏡下觀察比較兩者的粘附菌數,實驗結果表明△pk1對5637細胞的粘附能力較CFT073顯著減弱,提示ppk1可影響UPEC對宿主細胞的粘附能力。根據公式計算出菌株對膀胱癌上皮細胞5637的侵襲率,利用SPSS13.0對所得數據采用單因素方差分析,缺失株侵襲率為(0.18±0.04)%,
11、明顯低于野生株侵襲率(0.48±0.09)%,且P<0.05,差異具有統計學意義。這說明ppk1基因的敲除明顯減弱了尿路致病性大腸桿菌CFT073的侵襲能力。⑷比較ppk1缺失株和野生株在熱刺激、高滲透壓以及酸性培養(yǎng)條件下的生存率結果顯示,ppk1基因敲除后在這些壓力條件下的生存率均明顯下降,這也表明ppk1在CFT073抵抗外界環(huán)境壓力中具有重要作用。⑸用96孔板結晶紫染色法檢測野生株與缺失株生物膜形成能力差異,結果顯示兩菌株在生物膜
12、形成穩(wěn)定之前隨著培養(yǎng)時間的延長而增強,但缺失株在各時間段的生物膜形成能力均比野生株明顯減弱。經兩獨立樣本t檢驗分析,野生株與缺失株之間的差異具有統計學意義(P<0.05)。
結論:①利用Red同源重組技術可成功敲除CFT073的ppk1基因,從而成功構建ppk1基因缺失株△pk1。②ppk1基因對于 CFT073的形態(tài)和生長規(guī)律并無太大影響,ppk1缺失株的菌體和菌落形態(tài)以及在LB培養(yǎng)液中的生長能力與野生株一致,只是ppk1基
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