鼠衣原體質(zhì)粒缺失株的構(gòu)建及體外傳代對(duì)其生物學(xué)特性和致病性的影響.pdf

1、衣原體是一類嚴(yán)格真核細(xì)胞內(nèi)寄生、具有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物，可引起人和動(dòng)物多種疾病，疾病表現(xiàn)復(fù)雜。對(duì)人致病的衣原體有沙眼衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體等。衣原體感染已成為當(dāng)今世界具有挑戰(zhàn)性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題，對(duì)健康和經(jīng)濟(jì)有著巨大的影響。為有效應(yīng)對(duì)衣原體感染給公共衛(wèi)生所帶來(lái)的挑戰(zhàn)，加強(qiáng)衣原體基礎(chǔ)研究，深入研究其致病機(jī)制、研制衣原體疫苗成為世界范圍內(nèi)衣原體研究學(xué)者的重要研究課題。目前，鼠衣原體作為一種模式菌已廣泛應(yīng)用于人

2、類病原性衣原體致病機(jī)制研究和衣原體疫苗研究中。
　　一、鼠衣原體質(zhì)粒缺失株的構(gòu)建和鑒定
　　背景與目的：衣原體質(zhì)粒在衣原體致病中發(fā)揮重要作用，利用質(zhì)粒缺失菌株和質(zhì)粒攜帶菌株進(jìn)行比較研究，可以觀察研究質(zhì)粒的遺傳學(xué)功能，此外質(zhì)粒缺失菌株還可以用作基因工程菌，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究；因此構(gòu)建和鑒定衣原體質(zhì)粒缺失株具有重要意義。
　　方法：采用新生霉素處理鼠衣原體、噬斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)合以Pgp3為檢測(cè)標(biāo)志的間接免疫熒光分析方法篩

3、選鼠衣原體質(zhì)粒缺失株，進(jìn)一步采用PCR檢測(cè)質(zhì)粒基因，碘染色觀察糖原聚集現(xiàn)象，動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)其致病性。
　　結(jié)果：在96孔微孔板中進(jìn)行的篩選試驗(yàn)中，篩選到5個(gè)質(zhì)粒缺失菌株。通過(guò) PCR分析證實(shí)這些菌株缺乏質(zhì)?；?，此外，在上述菌株感染的HeLa細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GlgA蛋白的分泌現(xiàn)象，也無(wú)糖原聚集。質(zhì)粒缺失菌株CMUT3經(jīng)陰道感染C3H/HeJ小鼠未見(jiàn)誘導(dǎo)小鼠輸卵管積水。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了鼠衣原體質(zhì)粒缺失株。
　　二、體外

4、傳代對(duì)鼠衣原體生物學(xué)特性和致病性的影響
　　背景與目的：盡管鼠衣原體在實(shí)驗(yàn)室已傳代數(shù)十年，有關(guān)傳代選擇作用于鼠衣原體的結(jié)局尚未見(jiàn)報(bào)道。最近，我們對(duì)鼠衣原體質(zhì)粒缺失株CMUT3和野生型菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用“無(wú)輔助感染和輔助感染”交替的方式進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，然后觀察傳代的菌株感染細(xì)胞時(shí)對(duì)離心輔助感染因素的依賴性；傳代的CMG28和CMUT3G40在感染HeLa細(xì)胞時(shí)對(duì)離心這種輔助感染因素的依賴性降低。C3H/HeJ小鼠經(jīng)陰道感染鼠衣

5、原體野生型菌株CMG0和傳代的CMG28，陰道感染CMG28后引起的輸卵管積水病理變化與CMG0感染組相比，明顯降低。因此，傳代的鼠衣原體在體內(nèi)的致病性與體外細(xì)胞感染特性之間存在一個(gè)較大的差異。本實(shí)驗(yàn)的目的就是來(lái)探尋這種矛盾后面存在的可能機(jī)制。
　　方法：體外傳代培養(yǎng)鼠衣原體野生型菌株和質(zhì)粒缺失株至一定代數(shù)，提取基因組DNA，通過(guò)下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)CMG0、CMG28、CMUT3G5和CMUT3G40進(jìn)行全基因組測(cè)序，比較分析基因組

6、數(shù)據(jù)；同時(shí)動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)鼠衣原體的致病性。
　　結(jié)果：通過(guò)對(duì)CMG0和CMG28進(jìn)行深度基因組分析，CMG28和CMG0的基因組在3個(gè)開放讀碼框中存在顯著差異：TC0237（Q117E）替代突變（CMG28,100％；CMG0,0%），TC0668（G216*）無(wú)義突變（6.4% vs0%）和TC0668（G322R）替代突變（26% vs0%），和多個(gè)的TC0412突變多態(tài)性。吸附試驗(yàn)表明CMG28對(duì)細(xì)胞的吸附能力增強(qiáng)。CMG28

7、和CMG0經(jīng)陰道感染C3H/HeJ小鼠后，二者在小鼠體內(nèi)有著相似的上行感染能力，而CMG28感染組致輸卵管積水發(fā)生率明顯降低；Bio-plex200系統(tǒng)檢測(cè)顯示感染CMG28后小鼠輸卵管組織中炎性細(xì)胞因子顯著減少，這與輸卵管炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少相關(guān)。TC0237（Q117E）是CMG28和CMUT3G40共有的突變，提示TC0237（Q117E）與鼠衣原體體外吸附能力增強(qiáng)相關(guān)。
　　結(jié)論：鼠衣原體TC0237（Q117E）突變?cè)鰪?qiáng)