利用BAC克隆構(gòu)建PRV UL21缺失株及其生物學特性研究.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)，又叫做奧葉茲基氏病病毒(Aujeszky'sdisease virus)、豬皰疹病毒Ⅰ型（Suid herpesvirus1），屬于皰疹病毒科的α皰疹病毒亞科，是世界上廣泛存在的一種病原物。偽狂犬病毒的天然宿主分布廣泛，它能夠感染除高等靈長類以外的大多數(shù)哺乳動物，最主要的天然宿主是豬。偽狂犬病毒能引起母豬的呼吸道炎癥、流產(chǎn)、死胎，以及仔豬的死亡，在我國每年都能造成嚴重的經(jīng)濟損失

2、。偽狂犬病毒基因組長約為150Kb，其中包括長獨特區(qū)、短獨特區(qū)、內(nèi)部重復序列和末端重復序列。偽狂犬病毒基因組能夠編碼70種蛋白質(zhì)，分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩種。pUL21位于偽狂犬病毒的內(nèi)層被膜，在皰疹病毒科中諸多病毒都存在且序列保守，應(yīng)該是維持其毒力的重要基因。UL21基因被認為參與了病毒粒子的包裝過程，其缺失株在復制過程中出現(xiàn)大量的未加工的基因組串聯(lián)體，而且不含基因組的衣殼比例也大大增加。目前有研究表明，修復UL21突變的PRV B

3、artha株在神經(jīng)細胞中的逆向軸突感染的速度增加，表明pUL21可能與病毒運輸有關(guān)。
　　細菌人工染色體(bacteria artificial chromosome，BAC)是基于天然存在于大腸桿菌中的質(zhì)粒F因子設(shè)計的一種能夠容納大片段DNA插入序列的一種載體。BAC一經(jīng)問世，便被廣泛用于構(gòu)建真核生物基因組文庫。BAC文庫有穩(wěn)定性強、插入片段長、復制快、突變?nèi)菀椎膬?yōu)點。BAC用于克隆皰疹病毒基因組始于1997年，其首次應(yīng)用于小鼠

4、巨細胞病毒[1]，自此皰疹病毒的研究翻開了新的篇章。由于通過BAC能夠在大腸桿菌中利用原核重組系統(tǒng)對病毒基因組進行突變，省去了構(gòu)建重組毒時復雜繁瑣的過程，也節(jié)省了大量的時間，一時間該技術(shù)紛紛被用于各種皰疹病毒的基因編輯。
　　本研究出于研究UL21缺失對PRV增殖影響和新建立的BAC平臺構(gòu)建突變株效率的目的，構(gòu)建了UL21缺失株rPRV-△UL21及其回復突變株rPRV-△UL21R，并通過空斑大小比較實驗研究其生物學特性。在構(gòu)建

5、rPRV-△UL21時先將擴增的Kan表達盒電轉(zhuǎn)化含有pPRV Ea的GS1783，完成第一次Red重組;再分別誘導I-SceⅠ和Red操縱子表達，完成第二次重組。從兩次重組的PCR驗證來看，重組效率不是很穩(wěn)定，但每一輪都能挑到陽性克隆，而且并沒有受到質(zhì)粒殘留的影響。該結(jié)果說明BAC基因編輯平臺穩(wěn)定可靠，能夠短時間內(nèi)構(gòu)建重組病毒，為病毒基因功能研究節(jié)省大量的時間精力。最后western blot驗證結(jié)果表明，rPRV-△UL21完全不表

6、達UL21蛋白，說明PRV的UL21缺失株的構(gòu)建非常成功。
　　隨后進行的空斑大小比較實驗結(jié)果顯示，rPRV-△UL21感染MDBK細胞上所產(chǎn)生的空斑大小明顯小于PRV Ea株，但是減小的幅度并不大。這說明UL21的確影響PRV病毒在培養(yǎng)細胞上的增殖，但是其功能并不是復制必需的。
　　為了確保UL21基因的突變沒有影響與其重疊的lncRNA CTO-L的表達，本研究中采用了real time PCR來檢測感染病毒后12h的P