布魯氏菌S2308Asly缺失株構建及其生物學特征研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人、畜共患傳染病,該病在世界范圍內廣泛流行并嚴重危害著人、畜健康。
　　體內誘導基因與病原菌在宿主體內的生存和致病過程相關,開展對體內誘導基因在布魯氏菌致病過程中的作用研究,對闡明布魯氏菌病的發(fā)生發(fā)展以及致病機制具有參考意義。精氨基琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,Asly)是由本實驗室篩選和鑒定的布魯氏菌體內誘導抗原,為進一

2、步探討Asly在布魯氏菌體內感染過程中的作用,研究通過制備Asly單克隆抗體、構建Asly缺失株,開展對Asly生物學功能研究,探討Asly在布魯氏菌致病過程中的致病機制。試驗主要包括以下內容:
　　先以布魯氏菌S2308的基因組為模板擴增Asly基因的全長序列,將其克隆到原核表達載體pET-28a上,構建重組表達質粒pET28a-Asly,轉化大腸桿菌BL21后,進行誘導表達,SDS-PAGE檢測結果表明,融合蛋白His-Asl

3、y以可溶性方式表達。大量表達Asly融合蛋白,并用層析柱純化可溶性的融合蛋白His-Asly。Western blot檢測結果表明融合蛋白His-Asly有免疫原性。
　　使用純化的His-Asly免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合,用His-Asly蛋白為包被抗原,使用間接ELISA方法對融合細胞進行篩選,最終獲得了一株穩(wěn)定分泌Asly單克隆抗體的雜交瘤細胞株,命名為A5F2。BALB/c小鼠腹腔接種雜交瘤細

4、胞制備單抗腹水,采用間接ELISA方法和WB方法檢測單抗腹水效價,同時鑒定單抗的特異性和穩(wěn)定性。單抗鑒定結果表明,A5F2的單抗腹水效價為5.12×106,WB鑒定結果表明,該株雜交瘤細胞產生的單抗具有很強的特異性。
　　構建自殺質粒pUC19-U-C-D,將自殺質粒電轉化入S2308感受態(tài)細胞,利用同源重組使氯霉素抗性片段完全取代Asly基因的ORF。PCR篩選、鑒定雙交換的重組陽性菌株。陽性菌株以Asly單抗腹水作為一抗進行W

5、B檢測,結果表明,S2308野毒株的全菌蛋白能被Asly單抗腹水識別,而Asly基因缺失的菌株不能被識別。以上結果表明成功構建了S2308ΔAsly缺失株。
　　用S2308野毒株和構建的S2308ΔAsly缺失株感染MΦRAW264.7,提取細胞RNA并反轉錄,以本研究室建立的實時熒光定量(real-time)PCR方法檢測和分析S2308野毒株和構建的S2308ΔAsly感染RAW264.7后,RAW264.7細胞的TNF-α

6、、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10共6種細胞因子的轉錄水平的差異。結果表明:缺失株侵入至巨噬細胞后,在0h時,僅IL-4的表達水平與野毒株侵入后的表達水平差異顯著;2h和4h時,6種細胞因子的表達水平均有顯著的差異;8h時,IL-4、IL-6的表達水平無差異;36h時,IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達水平無差異。
　　為了解Asly基因的缺失對毒力因子的影響,應用本研究建立的方法對per、pmm

7、、sodC、virB4、virB5、virB8、BvrR、BvrS和OMP259種毒力因子的轉錄水平進行分析,結果表明,缺失株中pmm、BvrR、omp25和BvrS四種基因的轉錄水平降低,sodC、per、virB4、virB5和virB8的轉錄水平上調。
　　對野生株和缺失株的生長特性、黏附、侵入MΦ的能力及在MΦ的增殖能力進行了比較。結果表明:S2308ΔAsly對MΦ的黏附和侵入能力無明顯變化。胞內存活和增殖試驗結果表明,