致豬水腫病大腸桿菌ELISA抗體檢測(cè)方法及基因工程亞單位疫苗的初步研究.pdf

1、豬水腫?。≒orcine Edema disease，ED）是仔豬常見(jiàn)的一種急性致死性傳染病，主要由某些特定血清型產(chǎn)類(lèi)志賀毒素大腸桿菌（Shiga-like toxin Escherichia coli，SLTEC）引起的腸毒血癥。以胃大彎、腸系膜及腦部水腫為特征，常伴有共濟(jì)失調(diào)、麻痹或驚厥等神經(jīng)癥狀，主要發(fā)生于斷奶仔豬。采食量大、生長(zhǎng)快、體況健壯的豬最為常見(jiàn)。發(fā)病率通常為10％～35％，病死率可高達(dá)90％。豬群水腫病血清抗體的檢測(cè)對(duì)預(yù)

2、防和控制該病的爆發(fā)具有十分重要的意義。類(lèi)志賀毒素Ⅱ型變異體（SLT-Ⅱe）是直接導(dǎo)致豬水腫病發(fā)生的主要毒力因子，其是由一分子A亞基和5分子的B亞基共同組成的聚合體。A亞基是該毒素的主要毒力亞單位，為毒素的酶活性部位，具有細(xì)胞毒性作用。B亞基沒(méi)有毒性而具有免疫原性，是水腫病毒素的主要保護(hù)性抗原。本研究是針對(duì)SLT-Ⅱe的B亞基，初步建立一種特異、敏感、能對(duì)所有血清型豬水腫病大腸桿菌做出檢測(cè)的血清學(xué)檢測(cè)方法，為新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

3、 1．SLT-ⅡeB、SLT-Ⅱe3B基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá) 參照國(guó)外報(bào)道的Escherichia coli S1191菌株（M21534），設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，以本地分離的豬水腫病大腸桿菌鄂E（Ee）株基因組為模板，PCR擴(kuò)增出去掉信號(hào)肽和跨膜區(qū)的類(lèi)志賀毒素Ⅱ型變異體（SLT-Ⅱe）B亞基的序列，再利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ將SIL-ⅡeB基因融和串聯(lián)起來(lái)，篩選得到一個(gè)三拷貝SLT-ⅡeB

4、基因。將單拷貝和三拷貝SIL-ⅡeB基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-KG，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-SLT-ⅡeB和pGEX-SLT-Ⅱe3B。序列測(cè)定證實(shí)，SLT-ⅡeB基因全長(zhǎng)204bp，編碼68個(gè)氨基酸，未發(fā)生任何堿基突變，與NCBI上所發(fā)表的12個(gè)SLT-ⅡeB序列；AY368993、AY332411、X81417、X81416、X81415、AJ567999、AJ567998、AJ298298、AJ249351、AB252836、

5、M36727、M21534核苷酸同源性都是100％。SLT-Ⅱe3B基因全長(zhǎng)630bp，編碼210個(gè)氨基酸，與GenBank中M21534的序列同源性達(dá)到99.9％，只有第536處的點(diǎn)突變，由C變成T（C→T），相應(yīng)的氨基酸序列由脯氨酸突變?yōu)榱涟彼幔≒→L）。原核表達(dá)載體pGEX-SLT-ⅡeB、pGEX-SLT-Ⅱe3B轉(zhuǎn)化且coli BL2l（DE3），在IPTG誘導(dǎo)下獲得表達(dá)，大小與預(yù)期結(jié)果相符。表達(dá)產(chǎn)物均以包涵體形式產(chǎn)生，通過(guò)提

6、取包涵體──十二烷基肌氨酸鈉變性──透析復(fù)性的生化提純步驟來(lái)獲取有生物學(xué)活性的重組蛋白。Westernblot檢測(cè)證實(shí)表達(dá)蛋白與豬水腫病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)，具有良好的免疫學(xué)活性。同時(shí)用表達(dá)產(chǎn)物免疫SPF昆明系小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗體，為亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 2．豬水腫病SLT-Ⅱe3B-ELISA診斷方法的建立 將經(jīng)純化、變性、復(fù)性等處理后的GST-SLT-Ⅱe3B蛋白作為抗原，包被ELISA板，建立了特異、敏

7、感的豬水腫病SLT-IIe3B-ELISA抗體診斷方法。方陣滴定確定抗原最佳包被濃度為1:320，即3.15μg／mL，1:40為最佳血清稀釋濃度。對(duì)56份豬腫?。‥D）陰性血清進(jìn)行SL,T-IIe3B．ELISA測(cè)，計(jì)算得該56份血清的平均值？為0.199，SD為0.092，確定陰陽(yáng)性臨界點(diǎn)（？+2SD）為0.368。以該方法檢測(cè)豬偽狂犬病、口蹄疫、豬瘟、豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎、豬繁殖與呼吸綜合征、布氏桿菌病、豬傳染性胸膜肺炎、多殺性

8、巴氏桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)在4.48％~8.49％之間，變異系數(shù)（CV）<10％；批間重復(fù)變異系數(shù)在3.29％~10.28％之間，變異系數(shù)（CV）<15％，表明該試劑盒能進(jìn)行較好的批次間重復(fù)試驗(yàn)。并且在4℃至少可以保存6個(gè)月。與fedF-ELISA對(duì)比試驗(yàn)表明，二者的陽(yáng)性符合率為87.1％，陰性符合率為88.9％，總符合率為87.7％，由此可見(jiàn)，二者的符合率較高。利

9、用建立的。SI,T-IIe3B-EIJSA診斷方法對(duì)686份臨床送檢的各地豬血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得豬水腫病的陽(yáng)性率為26.7％。該方法的建立對(duì)豬水腫病流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防和控制該病的發(fā)生具有十分重要的意義。 3．基因工程類(lèi)毒素菌苗對(duì)小鼠的保護(hù)效力研究 利用SLT-IIe3B的表達(dá)產(chǎn)物和我國(guó)流行的0139型菌株，與等量弗氏不完全佐劑乳化后制成類(lèi)毒素菌苗，間隔兩周兩次皮下免疫小鼠，同時(shí)設(shè)純化GST-SLT-IIe3B蛋白組、細(xì)菌

10、滅活苗和空白對(duì)照組。利用ELISA檢測(cè)小鼠免疫后的抗體水平，二免后毒素的抗體均顯著升高。二免后兩周用5×LD<,50>的鄂E株大腸桿菌進(jìn)行腹腔攻毒。類(lèi)毒素菌苗組具有較高的抗體水平，保護(hù)效果為90.0％（9／10）優(yōu)于細(xì)菌滅活苗組70.0％（7／10）和純化GST-SLT-IIe3B蛋白組（6／10），能顯著降低臨床發(fā)病。攻毒結(jié)果還顯示毒素抗體和保護(hù)力呈正相關(guān)。研究結(jié)果初步表明表達(dá)產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)能激發(fā)很好的免疫反應(yīng)，對(duì)于同型菌有很好的保護(hù)