大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)番茄紅素研究.pdf

1、番笳紅素是一種重要的類(lèi)胡蘿卜素，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能阻止低密度脂蛋白(LDL)和膽固醇的氧化，防止動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生以及防治肺癌，膀胱癌，宮頸癌和皮膚癌等。近年來(lái)，番茄紅素的制備工藝，特別是發(fā)酵法生產(chǎn)，受到研究人員的重視。 所有類(lèi)胡蘿卜素均是由共同的前體異戊烯焦磷酸(IPP)合成而來(lái)的。異戊烯焦磷酸(IPP)的合成是通過(guò)典型的甲羥戊酸途徑或發(fā)現(xiàn)不久的非甲羥戊酸途徑合成的。在大腸桿菌中，IPP的生物合成是由中心代謝途徑的

2、中間產(chǎn)物丙酮酸和3-磷酸甘油醛(G3P)分支合成的。 該研究中，我們?cè)诖竽c桿菌工程菌(攜帶含歐文氏菌crtE，crtI和crtB基因的pACCRT-EIB質(zhì)粒，該質(zhì)粒有p15A復(fù)制起點(diǎn)，基因由自身的啟動(dòng)子控制)中過(guò)表達(dá)了能轉(zhuǎn)化IPP為番茄紅素的法尼基焦磷酸合成酶(jspA)和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因(idi)，通過(guò)控制中心碳代謝促進(jìn)番茄紅素合成。另外，結(jié)合代謝工程策略和優(yōu)化過(guò)程的實(shí)驗(yàn)以使番茄紅素產(chǎn)量最大化。主要內(nèi)容如下：

3、(1)從破壁方法、浸提溶劑及提取條件等方面對(duì)大腸桿菌工程菌番茄紅素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明酸-熱法是大腸桿菌工程菌破壁提取番茄紅素的最佳方法；丙酮是理想的提取溶劑。對(duì)破壁的條件(包括破壁的溫度、時(shí)間、酸的濃度及添加量等)和提取的條件(包括浸提溶劑的添加量及浸提溫度、時(shí)間等)進(jìn)行了分析研究。優(yōu)化得到適宜的破壁和提取條件為：鹽酸濃度為4mol/L、鹽酸溶液用量10 mL/g(濕菌體)、破壁溫度35℃、破壁時(shí)間20min、丙酮添加量2

4、0mL/g(濕菌體)、浸提溫度為40℃、浸提時(shí)間為2h、浸提級(jí)數(shù)為2次。 (2)研究了碳源、無(wú)機(jī)氮源、刺激物等對(duì)工程菌生長(zhǎng)及色素累積的影響，確定了合適的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為改良LB+M9培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5 g/L；甘油20 g/L；Na<,2>HPO<,4>．7H<,2>O 12.8 g/L；CaCl<,2>0.022 g/L；KH<,2>PO<,4> 3 g/L； NaCl 0.5 g/L；MgSO<,4> 0.

5、48 g/L；NH<,4>Cl l g/L；(NH<,4>)<,2>SO<,4>10 g/L；富馬酸鈉2 g/L；pH 7.0。)；培養(yǎng)溫度為33℃。發(fā)酵完成后工程菌的生物量(干重)為6.48g/L，番茄紅素的最高含量可達(dá)10.6mg/L。 (3)jspA，idi和，spA-idi基因的克隆和表達(dá)：法尼基焦磷酸到櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸的轉(zhuǎn)化是在大腸桿菌工程菌中合成類(lèi)胡蘿卜素的第一瓶頸，其次是異戊烯焦磷酸的異構(gòu)和法尼基焦磷酸的合成。移

6、走這些瓶頸將會(huì)提供足夠的前體來(lái)合成番茄紅素等類(lèi)胡蘿卜素。我們分別克隆了大腸桿菌DH5 Cc異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(由idi基因編碼)基因和法尼基焦磷酸合成酶(由ispA編碼)基因。兩個(gè)基因以及基因連接產(chǎn)物分別與歐文氏菌的基因簇(crtEIB)被導(dǎo)入大腸桿菌以產(chǎn)生抗氧化的橘紅色番茄紅素。番茄紅素產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果表明，工程菌DH5Cα(pACCRT-EIB，pUC19-ispA-idi)單位產(chǎn)量和單位體積產(chǎn)量分別提高了68.88﹪、68.92﹪。說(shuō)

7、明，引入的idi和ispA基因能夠提高原來(lái)基因工程菌的番茄紅素產(chǎn)量。 (4)構(gòu)建了基因工程菌BL21(DE3)(pACCRT-EIB，pET28a(+)-ispA-idi)，但菌生長(zhǎng)緩慢，番茄紅素產(chǎn)量下降。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-ispa-idi-EIB導(dǎo)入BL21(DE3)后，雖然能成功的合成番茄紅素，但由于菌體生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，番茄紅素產(chǎn)量十分低下。 (5)在搖瓶初步優(yōu)化條件基礎(chǔ)上進(jìn)行了7L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在更為優(yōu)化的pH