雞致病性大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及其免疫原性的研究.pdf

1、雞大腸桿菌病是一種由大腸埃希氏菌為原發(fā)性或繼發(fā)性病原體所致雞的一類疾病的總稱。十二世紀中期以后，隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，雞大腸桿菌病的危害日趨嚴重，特別是在雞的幾種重要病毒病得到有效控制后，由其造成的損失明顯上升，該病已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的主要細菌病之一。 本文分別對本實驗室保存的四株雞致病性大腸桿菌進行了形態(tài)學、生理生化鑒定以及藥敏實驗、毒力實驗的研究，又將此四株菌株按照適當?shù)谋壤苽淞舜竽c桿菌多價滅活疫苗，所制菌苗產(chǎn)生免疫力較早，免疫

2、保護期較長，具有較好的免疫原性。然后，以這四株菌株為研究對象，根據(jù)GenBank公布的致病性雞大腸桿菌的I型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列，分別設(shè)計了兩對引物，經(jīng)PCR特異性擴增出pilA基因和OmpC基因，序列分析表明擴增得到的基因與其參考菌株序列高度同源。進而，將擴增得到的兩個基因分別定向克隆到原核表達載體pET-28a中，得到兩個重組質(zhì)粒pETpilA和pETOmpC，轉(zhuǎn)化致受體大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株BL

3、21(DE3)(pETpilA)和BL21(DE3)(pETOmpC)，經(jīng)IPTG誘導后，由SDS-PAGE分析分別可見表達的20Ku和40.9Ku的特異蛋白條帶；Westemblot檢測說明表達的a毒素蛋白具有較好的反應(yīng)原性。又對已構(gòu)建的基因工程菌株BL21(DE3)(pET-pilA)和BL21(DE3)(pET-OmpC)，分別從溫度、接菌量、誘導時機、IPTG濃度、誘導時間等方面進行誘導條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示菌株BL21(DE3)

4、(pET-pilA)在40℃，接菌量80ul，誘導時機2.5h，IPTG濃度為0.96mM，誘導時間6h時得到最大蛋白表達量，而菌株BL21(DE3)(pET-OmpC)的最佳誘導條件為誘導溫度37℃，接菌量60ul，誘導時機2h，IPTG濃度為0.80mM，誘導時間5h。最后，將表達菌毛pilA蛋白和外膜蛋白C的菌株分別制成基因工程疫苗并進行初步的免疫原性研究，免疫小鼠后，保護能力分別達80％和60％，混合疫苗的保護力尤佳，高達100