豬水腫病大腸桿菌分離鑒定及fedF基因克隆和表達(dá)的研究.pdf

1、該研究分離了57株致豬水腫病大腸桿菌,對其中7株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性試驗(yàn)、生化特征、致病性試驗(yàn)、毒力因子的PCR檢測的研究.結(jié)果表明,上述7株菌形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性試驗(yàn)、生化特征符合大腸桿菌,對小鼠有較強(qiáng)的致病性,引起小鼠死亡;7株菌肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液能致死小鼠且剖檢見相關(guān)臟器水腫;對7株菌主要毒力基因SLT-IIe及F18擴(kuò)增,SLT-IIe全部陽性,5株F18為陽性,對LT1及ST1擴(kuò)增,則全為陰性.7株藥敏試驗(yàn)證明各菌株的耐藥譜不

2、同.7菌株感染斷奶仔豬,均能復(fù)制水腫病.該研究挑選菌株ED3(O139),該菌對小鼠致病力最大,測定了其對小鼠的半數(shù)致死量(LD50),該菌對小鼠的半數(shù)致死量為2.55×10<'8>CFU.另外制備了多價(jià)滅活菌體抗原,對其小鼠的免疫原性進(jìn)行了研究.我們用微量凝集法對菌體抗體進(jìn)行了測定,第7天可測到抗體,效價(jià)(GMT)為1:8;28天效價(jià)達(dá)到最高為1:128;55天仍然維持較高抗體效價(jià)1:64.F18菌毛是致豬水腫病的產(chǎn)Vero細(xì)胞毒素大

3、腸(VTEC)及某些產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)的主要毒力因子之一.菌毛F18主要亞單位有fedA、fedB、fedC、fedE及fedF,fedF基因與菌毛長度相關(guān),并是發(fā)揮黏附功能不可缺少的因子.該研究建立了fedF的PCR檢測方法,對404株致病性大腸桿菌進(jìn)行了擴(kuò)增,其中48株陽性,陽性率為11.9﹪.根據(jù)Genbank的序列設(shè)計(jì)兩對引物,用PCR的方法擴(kuò)增了大腸桿菌菌毛F18基因的主要亞基fedF的全長及去掉信號(hào)肽的亞克隆,擴(kuò)增

4、的片段大小約為1.0kb及0.9kb.將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18T中,上下游酶切位點(diǎn)為SacⅠ、HindⅢ,酶切分析證實(shí)所得陽性克隆,序列分析結(jié)果表明,含酶切位點(diǎn)的全長為967bp,鄂E株fedF基因編碼區(qū)全長903bp,編碼300個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),堿基序列同107/86株相比同源性為100﹪.與菌毛AF/R1比較,編碼的蛋白質(zhì)沒有同源性,fedF基因高度保守,是研制疫苗的良好候選基因.用pGEX-KG構(gòu)建了表達(dá)載體,SDS-P