淮南豬IL-2基因的克隆及在大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、白細(xì)胞介素2(Interleukin-2，IL-2)主要是由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要作用。其最重要的功能是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖(從G0期到S期)和分化，并且具有刺激T輔助細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等功能。本研究以豬IL-2為研究對(duì)象，首次克隆出了淮南豬IL-2全基因，然后分別亞克隆到原核與真核表達(dá)載體中，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了初步研究。主要內(nèi)容包括： 1.參照GenBank發(fā)表的豬IL-2cD

2、NA基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，將淮南豬脾淋巴細(xì)胞在伴刀豆球蛋白A(ConA)的刺激下體外培養(yǎng)27h后，提取激活淋巴細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增，然后克隆到pGEM-T Easy載體上并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆的淮南豬IL-2 cDNA全長(zhǎng)為516個(gè)堿基，開放閱讀框(ORF)包含465個(gè)堿基，編碼154個(gè)氨基酸，分子量為17.4 KDa，等電點(diǎn)為5.47，疏水氨基酸34％，親水氨基酸34％，堿性氨基酸11％，酸

3、性氨基酸23％。此cDNA與已報(bào)道的豬IL-2同源性為100％，與貓、牛、雞、狗、鴨、山羊、馬、人、家鼠等的IL-2基因進(jìn)行比較分析，核苷酸同源性分別為83.7％，82.6％，28.2％，80.6％，29.6％，83.4％，81.3％，82.0％，61.5％。 2.為了在大腸桿菌中表達(dá)淮南豬IL-2基因，并鑒定其生物學(xué)活性，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，將編碼淮南豬IL-2的成熟蛋白基因亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中，獲得重組質(zhì)粒pG

4、EX-IL-2，進(jìn)而轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞中；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE檢測(cè)淮南豬IL-2基因的表達(dá)情況，運(yùn)用Western-blot和MTT法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)和活性測(cè)定。結(jié)果表明，淮南豬IL-2基因在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，其表達(dá)蛋白具有特異性和生物學(xué)活性。 3.為了在桿狀病毒表達(dá)載體中表達(dá)豬IL-2基因，并鑒定其生物學(xué)活性，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，將編碼豬IL-2的成熟蛋白基因亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBa

5、cDual中，獲得重組質(zhì)粒pFBD-IL-2，進(jìn)而轉(zhuǎn)化含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用；經(jīng)抗性及藍(lán)白斑篩選得到含豬IL-2基因的重組質(zhì)粒rBacmid-IL-2。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，間接免疫熒光表明豬IL-2在Sf-9昆蟲細(xì)胞中獲得了表達(dá)，SDS-PAGE可檢測(cè)到分子質(zhì)量為20 KDa的重組蛋白，Western blot證實(shí)該重組蛋白可與兔抗豬IL-2單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后能明顯