豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒gag基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、根據(jù)已發(fā)表的PERV gag基因核苷酸序列,設(shè)計并合成用于擴(kuò)增PERV gag基因的引物,并在引物5'端分別引入Sal I、Not I酶切位點(diǎn).從中國實驗小型豬外周血淋巴細(xì)胞RNA中擴(kuò)增gag基因.將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞,挑白色菌落,經(jīng)過夜培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒,Not I、Sal I雙酶切鑒定、篩選陽性克隆組子.對陽性克隆,用ABI377自動序列分析儀進(jìn)行全序列測定,用DNASI

2、S和NCBI的BLAST2.0程序進(jìn)行同源性比較.序列分析結(jié)果表明,所克隆的gag基因全長工1572bp,編碼524個氨基酸;與其它來源的同源序列相比較,僅有三個核苷酸存在變異.分別是位于N端第1054位的C→T,位于N端第1180位的A→G,及位于N端第1560位的A→C的變異.為進(jìn)一步探討PERV gag蛋白的特性與功能.提取PERV gag重組質(zhì)粒pGEM-gag,Not I、Sal I雙酶切重組質(zhì)粒,凝膠純化后,插入經(jīng)同樣酶切處

3、理的pGEX-4T-3融合表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,菌落PCR和Not I、Sal I雙酶切鑒定陽性克隆.對陽性克隆用ABI377自動序列分析儀進(jìn)行全序列測定,測定顯示其具有正確的讀碼框.將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株,并對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定.結(jié)果,表達(dá)的GST-gag蛋白具有良好的抗原性和特異性,為從分子水平上對PERV gag蛋白的功能性研究和發(fā)展PERV基因工程監(jiān)測試劑奠定了基礎(chǔ).具有特異抗原性的GST融合蛋白的