大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因rob的克隆與表達(dá).pdf

1、抗生素在大腸桿菌病預(yù)防及治療方面有著不可替代的作用，但是隨著抗生素的不恰當(dāng)使用，由耐藥菌株引起的人及動(dòng)物感染性疾病不斷增加，大腸桿菌耐藥及多重耐藥現(xiàn)象已十分嚴(yán)重。主動(dòng)外排系統(tǒng)可引起細(xì)菌對(duì)多種抗生素高頻率、高水平耐藥。在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)存在AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE等主動(dòng)外排系統(tǒng)，其中AcrAB-TolC外排泵是大腸桿菌最主要的主動(dòng)外排系統(tǒng)。AcrAB-TolC包括藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB、間質(zhì)融合蛋白AcrA和外膜

2、通道蛋白TolC。AcrAB的表達(dá)水平受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，如acrR. marA、mppA、sdiA、rob和soxS等，其中，rob是其中的一個(gè)正向調(diào)控因子。 選取臨床分離的不同動(dòng)物源性大腸桿菌5株及大腸桿菌藥敏質(zhì)控株ATCC25922，分別以其染色體DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因rob片段，將上述基因片段分別與克隆載體pMD18-T simple Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM10

3、9感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)經(jīng)酶切與PCR反應(yīng)鑒定為陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒進(jìn)行插入片段的核苷酸序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明：不同動(dòng)物源性大腸桿菌的rob基因核苷酸序列及所推導(dǎo)的氨基酸序列與GeneBank中該基因序列的同源性較高，核苷酸序列同源性在98.7％～99.9％，氨基酸同源性在98.6％～100.0％。rob基因突變位點(diǎn)是否影響了rob對(duì)AcrAB-TolC外輸泵的調(diào)控作用，進(jìn)而影響其多重耐藥水平，還有待進(jìn)一步研究。 將重組質(zhì)粒pMD18-T-

4、rob和pPICZαA分別用KpnⅠ和XbaⅠ酶切后構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-rob，構(gòu)建后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞中，陽(yáng)性重組子甲醇誘導(dǎo)、目的基因酵母表達(dá)條件的優(yōu)化(甲醇濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)起始OD600值等)以及發(fā)酵上清濃縮液的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因rob在畢赤酵母中能夠表達(dá)，表達(dá)的目的蛋白的分子量約為33 kDa，與預(yù)測(cè)的分子量大小相符。 本試驗(yàn)獲得的臨床分離大腸桿菌