骨骼肌發(fā)育中miR-145a功能與qPCR內(nèi)參基因的研究.pdf

1、本文圍繞骨骼肌發(fā)育這一主題集中探討了兩個問題：miR-148a在骨骼肌發(fā)育中的作用及其作用機理；不同發(fā)育時期豬骨骼肌基因表達分析技術(shù)qPCR中內(nèi)參基因的選擇。主要工作及結(jié)果如下：
　　 1.骨骼肌發(fā)育中miR-148a的功能研究
　　 MicroRNA(miRNA)是一類進化上保守的非編碼小分子RNA。這類小RNA通過降解靶基因mRNA或者阻滯蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)控基因的表達。它們在早期發(fā)育、細胞增殖、分化和凋亡等一系列生物學(xué)

2、過程中發(fā)揮著極其重要的作用。
　　 在前期應(yīng)用深度測序技術(shù)(Deep Sequencing Approach)篩選出一系列在豬的胚胎和成年骨骼肌不同發(fā)育時期差異表達的miRNAs的研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)miR-148a在胚胎時期的骨骼肌組織中高表達，但在成年豬的骨骼肌中幾乎不表達。目前已經(jīng)報道m(xù)iR-148a與癌癥相關(guān)，但它在骨骼肌發(fā)育中的功能迄今還未見報道。
　　 在本研究中，我們從多個方面探討了miR-148a在骨骼肌

3、發(fā)育中的功能。我們發(fā)現(xiàn)并證實miR-148a能促進成肌細胞分化并一定程度阻滯細胞周期，以及miR-148a是通過抑制RhoA/ROCK信號通路中ROCK1的表達，從而實現(xiàn)對肌肉分化的正向調(diào)控。
　　 (1)我們首先建立了C2C12細胞體外分化模型，通過對miR-148a在分化第0天、1天、3天和5天表達的定量檢測，發(fā)現(xiàn)miR-148a隨著C2C12分化上調(diào)表達。
　　 (2)通過對過表達miR-148a后的C2C12細胞

4、進行全基因組表達譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)miR-148a過表達促進了一系列肌肉特異性基因的上調(diào)，并利用qPCR檢測了6個上調(diào)表達的肌特異性基因(Tnnt3、Mb、Mylpy、Myom3、myogenin和IGF2)的表達，驗證了芯片檢測結(jié)果。
　　 (3)誘導(dǎo)過表達或抑制miR-148a后C2C12和骨骼肌原代細胞分化，并檢測分化標(biāo)志基因MHC、myogenin和Skeletalα-actin在mRNA和蛋白水平上的表達變化。結(jié)果表明：

5、過表達miR-148a后分化標(biāo)志基因上調(diào)，反之抑制miR-148a后分化標(biāo)志基因下調(diào)，因此證明miR-148a能夠促進成肌細胞分化，具有正向調(diào)控肌肉分化的功能。
　　 (4)應(yīng)用CCK-8細胞增殖檢測方法分析miR-148a對C2C12細胞增殖的作用，結(jié)果表明過表達或抑制miR-148a對細胞增殖沒有影響；應(yīng)用流式細胞術(shù)分析miR-148a對C2C12細胞周期的影響，在C2C12中過表達miR-148a，發(fā)現(xiàn)miR-148a實驗

6、組中處于G1期的細胞比例顯著高于對照組(P<0.05)，而處于S期的細胞比例顯著低于對照組，說明miR-148a加強了G0/G1期的細胞阻滯，有利于肌細胞分化。
　　 (5)在探明miR-148a促進成肌細胞分化后，我們應(yīng)用TargetScan和miRanda軟件對miR-148a的靶標(biāo)基因進行預(yù)測，篩選出候選靶標(biāo)ROCK1基因(一種分化抑制基因)。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_定了ROCK1的3'UTR(非翻譯區(qū))含有miR-1

7、48a的作用靶位點，同時運用qPCR和western blot驗證了miR-148a抑制ROCK1的蛋白翻譯，而不影響其轉(zhuǎn)錄。
　　 (6)運用siRNA干擾C2C12和骨骼肌原代細胞內(nèi)源性ROCK1后，其表達受到抑制，而分化標(biāo)志基因的表達上調(diào)，這一結(jié)果說明ROCK1是分化抑制基因，而且干擾ROCK1表達可促進肌細胞分化。
　　 2.骨骼肌基因表達分析qPCR中內(nèi)參基因的選擇
　　 在基因表達分析，如定量PCR(

8、quantitative polymerase chain reaction，qPCR)中，通常用內(nèi)參基因(reference gene)來校正目標(biāo)基因的表達量。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種實驗因素條件下都恒定表達。但大量的研究結(jié)果證明，在不同組織、不同發(fā)育階段和不同實驗條件下，內(nèi)參基因的表達都存在不同程度的變化。因此，在基因表達轉(zhuǎn)錄分析qPCR中，選擇合適的內(nèi)參基因用于目標(biāo)基因表達量的校正，是得到準(zhǔn)確可靠數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。
　　 本研究主

9、要探討了豬不同組織和不同發(fā)育時期骨骼肌基因表達qPCR分析中內(nèi)參基因的選擇。我們首先應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測6個候選內(nèi)參基因(GAPDH、ACTB、H3F3A、HPRT1、RPL32和RPS18)，在通城豬和長白豬不同組織和不同胚胎時期骨骼肌(胚胎期第33天、65天和90天)中的表達量。通過運用NormFinder、BestKeeper和geNorm三種軟件評價這些候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性。我們的結(jié)果表明，這6個候選基因在不同豬種、不同組織

10、和不同發(fā)育階段的骨骼肌中都存在表達的不穩(wěn)定性，但其中表達較為穩(wěn)定的基因是RPS18、PRL32和H3F3A。
　　 本研究同時探討了以上3個內(nèi)參基因的組合。結(jié)果表明：在通城豬骨骼肌不同發(fā)育時期的基因表達分析中，H3F3A和RPS18是最合適的內(nèi)參基因組合；在長白豬骨骼肌不同發(fā)育時期的基因表達分析中，PRL32和RPS18是最合適的內(nèi)參基因組合；在通城豬和長白豬的不同組織中，PRL32和RPS18表達相對穩(wěn)定，再聯(lián)合H3F3A一起