骨骼肌特異表達IGF-1基因轉(zhuǎn)基因綿羊研究.pdf

1、自“多莉”誕生以來,體細胞核移植技術(shù)在家畜中的應(yīng)用的到了長遠的發(fā)展。以轉(zhuǎn)基因體細胞為供體細胞,利用核移植技術(shù)成產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜成為研究的熱點。本研究擬構(gòu)建骨骼肌特異表達胰島素生長因子Ⅰ真核表達載體,并轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細胞,篩選出外源目的基因穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因細胞克隆。以轉(zhuǎn)基因體細胞為核供體,通過體細胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因胚胎,并通過胚胎移植的移入受體綿羊體內(nèi),生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。
　　 1.骨骼肌特異表達載體的構(gòu)建
　　 1:通

2、過PCR克隆出豬血基因組α-actin5'端調(diào)控區(qū)與綿羊IGF-1cDNA序列相連得到中間載體p19T-CI,p19T-CI經(jīng)SphI+SacI酶切,得到目的片段CI,將CI連接到骨架載體pCDsReD2上,得到真核表達載體pCICDS,酶切鑒定插入是否正確:
　　 2.人工合成肌肉特異啟動子SP片段,和綿羊cDNA連接得到中間載體p19T-SPI,酶切p19T-SPI得到目的片段SPI,將SPI與骨架載體pCDsReD2相連,

3、得到表達載體pSPICDS,并酶切鑒定。構(gòu)建成功的真核表達載體均經(jīng)酶切鑒定證明插入位置正確,載體構(gòu)建成功。
　　 2.綿羊成纖維細胞的體外培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染
　　 使用組織貼壁法得到綿羊胎兒成纖維細胞,使用脂質(zhì)體Lip2000TM將骨骼肌特異表達載體pSPICDS、pCICDS轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細胞基因組中。使用G418藥物篩選轉(zhuǎn)基因細胞,同時利用紅色熒光蛋白進一步得到細胞克隆。通PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因細胞克隆來源胎兒性別與檢測

4、外源基因是否整合到細胞基因組中。通過繪制生長曲線與制備轉(zhuǎn)基因細胞染色體核型分析,評估轉(zhuǎn)基因細胞活性。結(jié)果證明獲得同時具有G418抗性與表達紅色熒光蛋白的細胞克隆,并鑒定出細胞性別,外源目的基因已經(jīng)穩(wěn)定整合入細胞基因組中,生長曲線與核型分析顯示轉(zhuǎn)基因細胞基本正常。表明我們得到的轉(zhuǎn)基因細胞可以作為供體細胞,用于體細胞核移植實驗。
　　 3.轉(zhuǎn)基因胚胎的制備與胚胎移植
　　 通過顯微操作的方法吸出成熟卵母細胞的第一極體和細胞核

5、,將轉(zhuǎn)pSPICDS、pCICDS轉(zhuǎn)基因SFCs供體細胞注入卵子。通過電融合將供體細胞與去核卵母細胞進行融合,5μMIA231875min+2mM6-DMAP4hr激活方法,激活重構(gòu)胚胎,并在體外發(fā)育液中進一步發(fā)育。通過PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎外源基因整合情況;使用激光共聚焦顯微鏡觀察紅色熒光蛋白的表達;挑取形態(tài)均勻的4～8細胞轉(zhuǎn)基因胚胎進行胚胎移植。綿羊卵母細胞成熟率為67％,融合率為61.7％,重構(gòu)胚胎卵裂率為79.5％,八細胞率為5