綿羊骨骼肌高表達(dá)miRNA靶基因文庫的高通量獲取及部分靶基因生物功能研究.pdf

1、為了掌握綿羊骨骼肌中miRNA的表達(dá)情況，深入探索其在綿羊骨骼肌發(fā)育過程中的表達(dá)特點(diǎn)及靶向調(diào)控的基因，進(jìn)一步闡明miRNA對(duì)綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為優(yōu)質(zhì)肉羊品種的培育提供理論基礎(chǔ)及新的育種手段。本研究首先以薩?？搜蚬趋兰椴牧?，使用芯片技術(shù)對(duì)其骨骼肌中miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，并以此為基礎(chǔ)對(duì)綿羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA從以下4個(gè)方面開展了深入研究：
　　首先，使用 PCR-SSCP（Polymerase chain re

2、action-single strand conformation polymorphism）技術(shù)對(duì)綿羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA前體序列在4個(gè)不同產(chǎn)肉性能綿羊品種中的突變進(jìn)行檢測(cè)，尋找在不同產(chǎn)肉性能綿羊品種間差異較大的突變，分析相關(guān)突變與綿羊產(chǎn)肉性能之間的關(guān)系。選擇7個(gè)對(duì)miRNA前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)能值影響不同的突變，構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過真核細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)及qRT-PCR檢測(cè)其對(duì)miRNA加工成熟的影響；
　　其次，使用qRT-PC

3、R技術(shù)檢測(cè)綿羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA在綿羊胚胎期第40 d、60 d、80 d、100 d、120 d以及初生、6月齡和周歲綿羊骨骼肌組織中的表達(dá)變化，并分析其與綿羊骨骼肌發(fā)育之間的關(guān)系；
　　第三，使用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的建庫技術(shù)，構(gòu)建綿羊胚胎期第60 d和成年羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA的靶基因文庫；
　　第四，以綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為材料，采用 qRT-PCR和 Western Blot技術(shù)研究miR-133過表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)

4、綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)以及miR-133的4個(gè)候選靶基因表達(dá)的影響，分析miR-133對(duì)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用。
　　通過以上試驗(yàn)，本研究得到了以下結(jié)果：
　　1.利用芯片技術(shù)在綿羊骨骼肌中共檢測(cè)到261個(gè)miRNA，其中58個(gè)為已報(bào)道的綿羊miRNA，其余203個(gè)在綿羊中尚未見報(bào)道；且這261個(gè)miRNA在同時(shí)期綿羊骨骼肌中的表達(dá)量不盡相同，其中有22個(gè)高表達(dá)的miRNA，其表達(dá)量占檢測(cè)到miRNA總表達(dá)量的89

5、％；
　　2.首次在16個(gè)miRNA前體序列中檢測(cè)到共計(jì)49個(gè)突變，其中包括41個(gè)單堿基突變和8個(gè)插入/缺失突變，另有6個(gè)miRNA前體序列沒有檢測(cè)到突變；對(duì)其中的3個(gè)突變?cè)?個(gè)產(chǎn)肉性能不同的綿羊品種共計(jì)640份基因組樣品中進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)miR-133a前體序列的CCC插入/缺失突變與綿羊的產(chǎn)肉性狀高度相關(guān)；89.8%的突變對(duì)miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)和成熟加工有影響，且突變對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)能值影響越大，突變位置離miRNA成熟序列

6、越近，對(duì)miRNA的成熟加工影響亦越大；
　　3.綿羊骨骼肌中22個(gè)高表達(dá)miRNA在綿羊骨骼肌發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)上調(diào)或者下調(diào)，其表達(dá)量按照4種基本的模式發(fā)生變化。胚胎期大部分miRNA出現(xiàn)了兩個(gè)低表達(dá)期，分別是胚胎期的40 d至60 d和120 d；
　　4.分別成功構(gòu)建了綿羊胚胎期和成年期骨骼肌高表達(dá) miRNA靶基因文庫。胚胎期文庫和成年期文庫分別測(cè)序250個(gè)單克隆，得到246條和239條有效序列，陽性克隆率分

7、別達(dá)到85%和79%。分別有132條和124條ESTs序列與NCBI中unigene序列匹配，占靶基因文庫的53.66%和51.88%；
　　5. miR-133過表達(dá)對(duì)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖具有抑制作用；miR-133在綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中可靶向調(diào)控Rhoa，CDC42，TAGLN2基因的表達(dá)，造成其蛋白表達(dá)量極顯著下調(diào)，但是對(duì)MSN基因沒有調(diào)控作用。miR-133在Rhoa和TAGLN2的CDS區(qū)分別有一個(gè)靶位點(diǎn)，其余靶位點(diǎn)