綿羊多胎性狀差異表達(dá)microRNA的篩選與靶基因驗(yàn)證.pdf

1、小尾寒羊產(chǎn)羔率高，平均產(chǎn)羔率為281.9％，而吐魯番黑羊是典型的產(chǎn)單羔綿羊，單羔率為99.3％。多胎性狀是綿羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，是決定繁殖率的關(guān)鍵因素之一。然而，多胎性狀是受多基因控制的且遺傳力低，利用傳統(tǒng)的選擇方法培育新的高繁殖率品種是相當(dāng)繁瑣的。構(gòu)建小尾寒羊和吐魯番黑羊卵巢組織miRNA表達(dá)譜，篩選與綿羊多胎性狀相關(guān)的miRNAs，為培育新高繁殖率品種提供新的方向。
　　本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了小尾寒羊和吐魯番黑羊發(fā)

2、情期、間情期四個(gè)卵巢組織樣品的miRNA cDNA庫(kù)。結(jié)果表明:四個(gè)樣品組織分別獲得了11467290、10667271、11133001、10793522條純凈reads;對(duì)這些reads進(jìn)行長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)，在22nt處達(dá)到峰值;采用miRDeep程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，在四個(gè)卵巢樣品中分別獲得194、191、188、187個(gè)miRNAs，其中已知miRNA分別為135、134、136、129個(gè)，未知miRNA分別為59、57、52、5

3、8個(gè);oar-miR-99a是小尾寒羊間情期表達(dá)量最為豐富的miRNA，而oar-miR-143是小尾寒羊發(fā)情期、吐魯番黑羊發(fā)情期和間情期三個(gè)樣品中表達(dá)量最豐富的miRNA。通過(guò)對(duì)同一個(gè)體發(fā)情期和間情期表達(dá)的miRNAs進(jìn)行比較，篩選出小尾寒羊發(fā)情期與間情期中3個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNAs（log2Foldchange＜-1），吐魯番黑羊發(fā)情期與間情期存在19個(gè)顯著差異表達(dá)miRNAs（log2Foldchange＜-1），對(duì)其靶基因進(jìn)

4、行GO富集和KEGG通路分析，推測(cè)差異表達(dá)的miRNAs通過(guò)代謝和免疫途徑調(diào)控綿羊相關(guān)的繁殖過(guò)程;通過(guò)多胎與單胎羊之間的比較，篩選出小尾寒羊與吐魯番黑羊間情期之間34個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（log2Foldchange＜-1），推測(cè)這些miRNAs與綿羊多胎性狀相關(guān)，為培育新的高繁殖率品種提供新的方向和思路。
　　采用熒光素酶報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-150、miR-27a進(jìn)行靶基因的驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明:StAR基因?yàn)閙iR-150

5、的一個(gè)靶基因，而CREB1不是miR-27a的靶基因。StAR為固醇類激素生成過(guò)程中重要的限速酶，推測(cè)miR-150是通過(guò)作用于StAR影響孕酮的生成，從而對(duì)綿羊的卵泡發(fā)育、排卵、排卵數(shù)、產(chǎn)羔率產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。而miR-27a不是通過(guò)CREB1調(diào)節(jié)綿羊的繁殖活動(dòng)。
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)oar-miR-23b、oar-miR-200b、oar-miR-150、oar-miR-19b、oar-miR-194、oar-miR-2