Fank1基因敲減小鼠差異表達(dá)基因篩選及驗(yàn)證.pdf

1、目的：在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)中,轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor TF)是一類(lèi)可以和DNA序列特異結(jié)合的蛋白質(zhì),控制著遺傳信息從DNA到RNA轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄因子以單獨(dú)形式或者與其他蛋白形成復(fù)合物的形式通過(guò)啟動(dòng)或者抑制RNA聚合酶來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄,包含一個(gè)或者多個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域,可以和其調(diào)控的基因的DNA序列結(jié)合。轉(zhuǎn)錄因子從功能上可將轉(zhuǎn)錄因子分為兩類(lèi),即普遍性轉(zhuǎn)錄因子和激活轉(zhuǎn)錄因子。普遍性轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組成成員,主要

2、功能是將RNA聚合酶定位在核心啟動(dòng)子上,為啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄所必需。激活轉(zhuǎn)錄因子可影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝及轉(zhuǎn)錄效率,決定某一基因是否表達(dá)。它們?cè)谡婧松锘虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控中占有十分重要的地位,是基因表達(dá)調(diào)控的核心內(nèi)容之一。Fankl(fibronectin typeⅢ and ankyrin repeat domains1)是一個(gè)睪丸特異表達(dá)基因,編碼一種核蛋白,在精子發(fā)生過(guò)程的減數(shù)分裂到單倍體階段廣泛表達(dá),相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明該蛋白為睪丸組織特異T

3、F。前期研究中我們已經(jīng)運(yùn)用CAST實(shí)驗(yàn)篩選得到與Fankl特異結(jié)合的DNA靶點(diǎn)。本研究中通過(guò)基因芯片分析得到差異表達(dá)基因,進(jìn)行聚類(lèi)分析,相互作用分析,找出與Fankl相互作用的一組基因,為進(jìn)一步找出Fankl的信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。對(duì)該基因的深入研究可能會(huì)有助于對(duì)精子發(fā)生及調(diào)控機(jī)制的深入了解,從而對(duì)揭示精子發(fā)生的精細(xì)調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵性作用。
　　 方法：通過(guò)基因芯片分析Fank/Knockdown(KD)小鼠與同窩陰性小鼠,獲得差異表達(dá)

4、的基因。生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析,相互作用分析,找出與Fankl相互作用的網(wǎng)絡(luò)。把差異表達(dá)基因啟動(dòng)子與我們前期實(shí)驗(yàn)得到的與Fankl TF特異結(jié)合的DNA核心序列進(jìn)行比對(duì),從而得到受Fankl調(diào)控的下游基因。我們從中挑選出感興趣的基因,在細(xì)胞水平,構(gòu)建一個(gè)Fankl表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,檢測(cè)目的基因表達(dá)變化,驗(yàn)證目的基因和Fankl的相互作用;在動(dòng)物水平,通過(guò)檢測(cè)KD小鼠和同窩陰性小鼠睪丸組織目的基因表達(dá)差異,

5、驗(yàn)證芯片結(jié)果;通過(guò)檢測(cè)KD小鼠和同窩陰性小鼠心、肝、肺、腎、睪丸組織中目的基因的表達(dá),驗(yàn)證差異表達(dá)是否發(fā)生在睪丸組織中。
　　 結(jié)果：
　　 1、芯片分析得到差異表達(dá)的基因355個(gè),其中上調(diào)243個(gè),下調(diào)112個(gè)。在這些數(shù)據(jù)中,差異趨勢(shì)一致的有25個(gè),其中上調(diào)16個(gè),下調(diào)9個(gè)。
　　 2、差異趨勢(shì)一致的差異表達(dá)基因中有10個(gè)基因的啟動(dòng)子中含有CAST得到的與Fankl轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的核心序列(AAAAAG)。<