楊樹miRNA基因家族進(jìn)化與靶基因研究.pdf

1、楊樹是重要的速生用材樹種。隨著毛果楊基因組測(cè)序的完成和相關(guān)遺傳學(xué)和生物信息學(xué)研究的開展，目前楊樹已成為公認(rèn)的木本模式植物。對(duì)于許多生物學(xué)問(wèn)題，例如木材形成、細(xì)胞壁次生生長(zhǎng)、多年生生長(zhǎng)、開花調(diào)控、生物進(jìn)化、逆境脅迫響應(yīng)等，楊樹具有重要的研究?jī)r(jià)值。miRNA是一類廣泛存在于動(dòng)植物的內(nèi)源調(diào)控小分子RNA，在植物中主要通過(guò)序列互補(bǔ)介導(dǎo)靶mRNA的降解以抑制靶基因的表達(dá)，從而參與植物發(fā)育調(diào)控與逆境脅迫響應(yīng)。研究miRNA有助于揭示很多生命現(xiàn)象的分

2、子機(jī)理，并可能應(yīng)用于作物和林木的遺傳改良。本文研究了楊樹7個(gè)保守程度不同的miRNA基因家族的分子進(jìn)化模式，進(jìn)一步通過(guò)降解組分析鑒定miRNA靶基因并進(jìn)行基因本體富集分析，并對(duì)2個(gè)miRNA靶基因進(jìn)行了分離克隆與功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.楊樹MIR169基因家族的分子進(jìn)化分析。串聯(lián)重復(fù)和16.6～83.1百萬(wàn)年前的染色體大片段重復(fù)在毛果楊MIR169基因家族擴(kuò)張中均發(fā)揮了重要作用;部分重復(fù)基因在進(jìn)化過(guò)程中丟失;植物MI

3、R169基因在單子葉植物與雙子葉植物分化前已經(jīng)分化為MIR169_1和MIR169_2兩個(gè)家族，在楊樹中又分別從MIR169_1和MIR169_2家族中分化出MIR169_4和MIR169_3家族。MIR169基因家族在表達(dá)方式上已經(jīng)出現(xiàn)了較大的分化，其中MIR169u在多種組織中具有最高的表達(dá)活性;楊樹MIR169基因家族的預(yù)測(cè)靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等多種基因，其中轉(zhuǎn)錄因子NF-YA是楊樹MIR169主要的靶基因;MIR169基

4、因家族可能在楊樹中形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)楊樹的生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)性等具有重要的調(diào)控作用。
　　2.楊樹MIR171基因家族的分子進(jìn)化分析。楊樹MIR171基因家族主要通過(guò)48～54百萬(wàn)年前的染色體大片段重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)張，其表達(dá)方式已經(jīng)出現(xiàn)分化，其中MIR171l/m/n在多種組織中具有最高的表達(dá)水平。MIR171基因家族可能主要通過(guò)調(diào)控GRAS轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白參與楊樹生長(zhǎng)發(fā)育、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和光形態(tài)建成的調(diào)控。
　　3.楊樹MI

5、R156基因家族的分子進(jìn)化研究。楊樹MIR156基因家族主要通過(guò)染色體大片段重復(fù)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)張，而串聯(lián)重復(fù)對(duì)此沒(méi)有貢獻(xiàn);不同家族成員表達(dá)方式已經(jīng)分化，其中MIR156g/h/i/j表達(dá)活性最高;家族成員間啟動(dòng)子順式作用元件存在差異;楊樹MIR156的靶基因包括29個(gè)SBP結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)基因，由于成熟序列存在差異，家族成員調(diào)控的靶基因也表現(xiàn)出差異，說(shuō)明楊樹MIR156基因家族成員的功能已經(jīng)分化，在楊樹中可能形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　4.楊

6、樹4個(gè)新起源miRNA家族的進(jìn)化。楊樹MIR1444家族主要通過(guò)染色體大片段重復(fù)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)張，MIR1446家族主要通過(guò)染色體大片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)張，而非保守的MIR6425、MIR6462家族主要通過(guò)串聯(lián)重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)張;這4個(gè)基因家族成員的表達(dá)方式均已經(jīng)分化，其中MIR1444、MIR1446在多種組織中具有較高的表達(dá)活性，而MIR6425、MIR6462僅具有較低的表達(dá)活性;MIR1446、MIR6425、MIR6462家族內(nèi)不同成

7、員的成熟序列基本一致，其預(yù)測(cè)的靶基因也一致，而MIR1444家族中不同成員的成熟序列則出現(xiàn)了一定程度的分化，其預(yù)測(cè)的靶基因也不一致。對(duì)以上7個(gè)不同保守程度的miRNA基因家族的比較分析表明:起源較早、保守程度較高的miRNA基因家族成員數(shù)量較多，表達(dá)活性較高，功能分化程度較高，主要通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子在楊樹生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用;而起源較晚、保守程度較低的miRNA基因家族成員數(shù)量較少，表達(dá)活性較低，功能分化程度較低，其調(diào)控的靶基因多

8、為酶等功能蛋白。
　　5.楊樹降解組分析與miRNA靶基因富集分析。構(gòu)建了胡楊葉片降解組文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得42659177條原始序列，去除接頭、污染序列及低質(zhì)量序列后得到了34657804條干凈序列用于降解組分析，共鑒定了23個(gè)miRNA靶基因?；蚋患治鼋Y(jié)果表明，胡楊葉片降解組分析中鑒定的miRNA靶基因富集于氧化還原酶活性和抗氧化活性，參與細(xì)胞氧化還原平衡的維持。這說(shuō)明miRNA可能在楊樹鹽脅迫條件下對(duì)清除ROS、維

9、持氧化還原的平衡具有重要的調(diào)控作用。對(duì)楊樹、擬南芥和水稻高度保守和低度保守miRNA的預(yù)測(cè)靶基因分別進(jìn)行單一富集分析和交叉比對(duì)。發(fā)現(xiàn)這三種植物的高度保守miRNA的預(yù)測(cè)靶基因都顯著富集于轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)楊樹高度保守miRNA的預(yù)測(cè)靶基因顯著富集于氧化還原過(guò)程，而低度保守miRNA靶基因富集程度較低。
　　6.楊樹miRNA靶基因的克隆與功能分析。從胡楊中克隆了MIR171的靶基因Pescl1的全長(zhǎng)cDNA，Pescl1屬于GR

10、AS轉(zhuǎn)錄因子家族。RLM5'RACE實(shí)驗(yàn)證明Pescl1存在miR171 a-3p/b的靶位點(diǎn)。在鹽脅迫條件下，Pescl1表達(dá)水平上調(diào)，說(shuō)明Pescl1參與了楊樹鹽脅迫響應(yīng)。從胡楊中克隆了MIR1444的預(yù)測(cè)靶基因Pecngc1的全長(zhǎng)cDNA。Pecngc1屬于環(huán)核苷酸門離子通道基因家族。PeCNGC1定位于細(xì)胞膜，轉(zhuǎn)Pecngc1能提高擬南芥的耐鹽性。Pecngc1在葉片中表達(dá)，且其表達(dá)受鹽脅迫條件的誘導(dǎo)，說(shuō)明鹽脅迫條件下Pecng