參與柑橘果實(shí)發(fā)育的miRNA和靶基因的挖掘與分析.pdf

1、柑橘是重要水果，提升柑橘果實(shí)品質(zhì)一直是柑橘育種工作最重要的目標(biāo)之一。研究調(diào)控柑橘果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)理可以為柑橘分子育種工作奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。參與調(diào)控果實(shí)發(fā)育的調(diào)控因子除了為人熟知的轉(zhuǎn)錄因子外，還有廣泛參與到植物各個(gè)階段生長(zhǎng)發(fā)育的microRNA(miRNA)。miRNA是20-24nt的小分子RNA，由具有莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)的MIR基因編碼，經(jīng)過(guò)剪切形成成熟體，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)全面地鑒定了柑橘miR

2、NA及靶基因，并從測(cè)序數(shù)據(jù)中挖掘了參與調(diào)控柑橘果實(shí)發(fā)育的miRNA及靶基因。它們分別是miR164-Cs5g10870(NAC轉(zhuǎn)錄因子)和miR477a-3p-Cs6g19680（SEP轉(zhuǎn)錄因子），隨后本研究探索并分析了它們?cè)诟涕俟麑?shí)發(fā)育及成熟過(guò)程中的生物學(xué)功能。此外，本研究還利用組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)在全基因組范圍內(nèi)鑒定了甜橙中潛在的TAS基因及其產(chǎn)生的phasiRNA，分析了miR3954a及由其靶定Cs1 g09600和Cs1g0965觸發(fā)

3、產(chǎn)生的phasiRNA的功能。具體研究結(jié)果如下:
　　1.sRNA組及降解組高通量測(cè)序挖掘柑橘miRNA及靶基因
　　本研究以暗柳甜橙（Citrus sinensis），紅暗柳甜橙的葉、花和果實(shí)，以及紫皮柚（C.grandis）紫色黃皮層、普通柚子黃皮層、紅肉琯溪蜜柚紅色果肉和普通琯溪蜜柚白色果肉為材料，進(jìn)行高通量sRNA組學(xué)測(cè)序及降解組測(cè)序。分別以已經(jīng)公布的紅夏橙基因組序列和未公布的晚白柚基因組序列為參考序列，本研究在甜橙

4、中鑒定了183個(gè)已知miRNA以及38個(gè)新miRNA;在柚子中鑒定了106個(gè)已知miRNA以及12個(gè)新miRNA。在甜橙葉片中鑒定了107個(gè)miRNA的405個(gè)靶基因;甜橙花中鑒定了166個(gè)miRNA的265個(gè)靶基因;甜橙果實(shí)中鑒定了118個(gè)miRNA的322個(gè)靶基因。
　　2.柑橘果實(shí)發(fā)育成熟相關(guān)miRNA及靶基因挖掘及功能分析
　　基于甜橙葉、花以及果實(shí)的sRNA組學(xué)的數(shù)據(jù)分析，本研究從中獲得了80個(gè)甜橙葉片或花或果中高

5、表達(dá)miRNA，通過(guò)qRT-PCR及northern雜交對(duì)這80個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證并篩選出葉片或花或果中顯著高表達(dá)的miRNA。結(jié)果表明，miR482d-5p.2、miRN03及miRN36在甜橙葉片中高表達(dá);miR3954a、miR167b.2、miR5179及miRN08在甜橙花中高表達(dá);miR3951、miR164、miRN31及miR477a-3p在甜橙果實(shí)中高表達(dá)。本研究通過(guò)5'RACE以及煙草瞬時(shí)表達(dá)體系驗(yàn)證了其中關(guān)鍵mi

6、RNA的靶基因。在分析了關(guān)鍵miRNA及靶基因在甜橙果實(shí)8個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式后，本研究發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵miRNA和相應(yīng)的靶基因隨著果實(shí)的發(fā)育呈相反的表達(dá)模式。其中miR164在甜橙果實(shí)發(fā)育后期（成熟時(shí)期）高表達(dá)，而且表達(dá)水平有一個(gè)穩(wěn)步的提升。這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明miR164可能參與調(diào)控甜橙果實(shí)的成熟;miR477a-3p和miRN31有著極為類(lèi)似的表達(dá)模式，它們?cè)谔鸪然ê?40天到170天（破色期）的表達(dá)量有個(gè)驟然地變化，意味著它們很可能在甜橙果

7、肉破色期扮演著調(diào)控因子的角色。為驗(yàn)證miR164及miR477a-3p在柑橘果實(shí)發(fā)育及成熟過(guò)程中的功能，本研究構(gòu)建miR164及其靶基因mimic超表達(dá)載體，并將它們轉(zhuǎn)化至早實(shí)枳，最終獲得1棵miR164超表達(dá)陽(yáng)性植株以及4棵miR164靶基因mimic超表達(dá)陽(yáng)性植株。同樣，本研究構(gòu)建miR477a-3p及其靶基因mimic超表達(dá)載體，并將它們轉(zhuǎn)化至山金柑，最終獲得5株miR477a-3p超表達(dá)陽(yáng)性植株以及3棵miR477a-3p靶基因

8、mimic超表達(dá)陽(yáng)性植株。由于柑橘外植體轉(zhuǎn)化及再生周期偏長(zhǎng)，目前尚未觀察到能夠指示miR164及miR477a-3p功能的表型。
　　3.甜橙phasiRNA的鑒定及由miR3954a觸發(fā)產(chǎn)生phasiRNA的功能分析
　　本研究利用甜橙葉、花及果的sRNA組學(xué)及降解組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在甜橙中有能力觸發(fā)靶基因產(chǎn)生phasiRNA的miRNA共有7個(gè)，分別是miR167.2、miR2118.1、miR482a-3p、miR482c

9、、miR827.2、miR3954a和miRN20，這7個(gè)miRNA分別觸發(fā)其靶基因產(chǎn)生共235條phasiRNA，其中包括48條高豐度phasiRNA，這48個(gè)phasiRNA在甜橙中共靶定243個(gè)靶基因，參與甜橙生長(zhǎng)發(fā)育中不同的生物學(xué)過(guò)程。其中miR3954a靶定Cs1g09600和Cs1g09635，共產(chǎn)生8條高豐度的phasiRNA。為驗(yàn)證miR3954a及其觸發(fā)產(chǎn)生的8條phasiRNA在甜橙發(fā)育中的功能，本研究構(gòu)建了miR3

10、954a及其靶基因mimic超表達(dá)載體，并將它們轉(zhuǎn)化至山金柑，最終獲得17棵miR3954a超表達(dá)陽(yáng)性植株以及1棵miR3954a靶基因mimic超表達(dá)陽(yáng)性植株。本研究發(fā)現(xiàn)miR3954a超表達(dá)子代植株有三個(gè)株系顯著提早開(kāi)花。通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析，本研究發(fā)現(xiàn)在miR3954a超表達(dá)植株中由miR3954a觸發(fā)產(chǎn)生的phasiRNA同樣被超量表達(dá)，而這些phasiRNA的30個(gè)靶基因均下調(diào)表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示miR3954a、由其觸發(fā)產(chǎn)生