豬骨骼肌相關(guān)miRNA的鑒定及miR-378對(duì)肌肉發(fā)育調(diào)控的研究.pdf

1、肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程:首先，成肌細(xì)胞在一系列的MRFs的調(diào)控下，由增殖階段進(jìn)入分化階段，幾個(gè)成肌細(xì)胞相互融合，形成多核的肌管，肌管進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞核逐漸向周圍分散，最終形成肌纖維。越來越多的研究表明，miRNA對(duì)于不同階段的肌肉發(fā)育都有著重要的調(diào)控作用，但是大多數(shù)的研究主要集中在miR-1、miR-133、miR-206等肌肉特異性miRNA中。為了篩選出更多與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的miRNA，本研究利用solexa測(cè)序技術(shù)，鑒定

2、骨骼肌中存在的miRNA。這對(duì)研究miRNA在骨骼肌中的生物學(xué)功能有著重要的指導(dǎo)作用。
　　 1.豬骨骼肌中miRNA的鑒定因?yàn)榧∪庠诎l(fā)育的不同時(shí)期，具有不同的生理狀態(tài)，而且參與其發(fā)育調(diào)控的基因也不同，這預(yù)示著在不同的發(fā)育階段，miRNA表達(dá)的種類及豐度也有可能有著巨大的不同。在本研究中，為了盡可能全面的覆蓋并鑒定出與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的miRNA，與別人的研究相比，我們選取了更多的胚胎發(fā)育時(shí)間點(diǎn)，采集了懷孕期33、40、45、5

3、0、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105天，出生后0、10天，以及成年通城豬的背肌，制作總RNA混池，進(jìn)行solexa測(cè)序。共得到23813176個(gè)總測(cè)序值，19937559個(gè)高質(zhì)量的測(cè)序值。去除不含3'引物以及無(wú)插入片段的序列，去除含有polyA尾的序列、出現(xiàn)5'端污染的序列以及長(zhǎng)度小于18nt的序列，共得到19854980個(gè)干凈的sRNA序列。sRNA的長(zhǎng)度主要分布在21～23 nt，并在22 nt處

4、形成一個(gè)峰值。共有164783個(gè)unique sRNA以及15182311個(gè)total sRNA能與豬的基因組匹配，分別占各自總數(shù)的39.69％與76.47％。為了使每個(gè)unique sRNA有唯一的注釋，按照rRNA(etc)＞已知miRNA＞重復(fù)序列＞外顯子＞內(nèi)含子的優(yōu)先級(jí)順序?qū)RNA進(jìn)行分類注釋，GenBank及Rfam兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)先級(jí)為GenBank＞Rfam。沒有比對(duì)上任何注釋信息的sRNA用于預(yù)測(cè)novel miRNA。

5、最終得到了3407個(gè)unique miRNA、14034350個(gè)totalmiRNA，代表了172個(gè)成熟miRNA。通過與豬的基因組進(jìn)行BLASTN比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在solexa測(cè)序結(jié)果中有78個(gè)序列可能是novel miRNA。miRNA的“種子”序列對(duì)于靶基因的識(shí)別起著最關(guān)鍵的作用，在本研究鑒定出的所有miRNA中，有42個(gè)在“種子”序列內(nèi)出現(xiàn)了單核苷酸突變。
　　 部分高豐度的成熟miRNA組織譜qPCR結(jié)果表明:ssc-miR

6、-7a與ssc-miR-21在不同的組織中都有表達(dá)，說明此類miRNA在動(dòng)物體內(nèi)具有普遍的調(diào)控作用;ssc-miR-206只在骨骼肌中表達(dá)，而ssc-miR-1在骨骼肌與心肌中都有表達(dá);ssc-miR-378在骨骼肌與心肌中的表達(dá)量明顯高于其它組織，推斷其在肌肉中可能具有比較重要的生物學(xué)功能;ssc-miR-10b在肌肉中也有較高的表達(dá)，但在腎中表達(dá)量最高;ssc-miR-181a在肌肉、脾、腎、小腸與結(jié)腸中的表達(dá)量都很高;ssc-mi

7、R-30d在肌肉與腎中的表達(dá)量較高;ssc-miR-127在肌肉與脾中的表達(dá)量較高;ssc-miR-143在結(jié)腸中表達(dá)較高;ssc-miR-148a在肝與結(jié)腸中表達(dá)較高;ssc-miR-30a在腎中的表達(dá)量較高;ssc-miR-199a在背肌中的表達(dá)量較高，而在腿肌中的表達(dá)量較低，可能是由于不同類型的骨骼肌中，Ⅱ型MyHC的含量不同造成的。
　　 本實(shí)驗(yàn)還采集了懷孕期33、65、90天，出生后0、10、100、180天以及成年通

8、城豬的背肌，利用qPCR的方法檢測(cè)了ssc-miR-378在不同的發(fā)育階段背肌中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)ssc-miR-378在出生前總體的表達(dá)趨勢(shì)是上升的，出生第0天達(dá)到最大表達(dá)量，出生以后，表達(dá)量逐漸下降，推測(cè)ssc-miR-378可能對(duì)胚胎期肌纖維的形成具有促進(jìn)作用。
　　 2.miR-378在肌肉發(fā)育過程中的生物學(xué)功能小鼠mmu-miR-378的組織譜qPCR結(jié)果表明，mmu-miR-378在骨骼肌中的表達(dá)量較高，與豬的組織譜結(jié)

9、果相類似，證明miR-378在豬與鼠的表達(dá)模式具有保守性，推測(cè)其在肌肉發(fā)育調(diào)控方面的功能也具有保守性。C2C12小鼠成肌細(xì)胞在分化的過程中，miR-378的表達(dá)逐漸增加，在分化的第2天達(dá)到最大，之后miR-378的表達(dá)量維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，推測(cè)miR-378可能具有促進(jìn)分化的作用。為了了解miR-378能夠引起哪些下游基因及通路發(fā)生變化，本研究在C2C12中過表達(dá)miR-378，利用基因芯片篩選表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)的基因，對(duì)所有2倍下調(diào)的

10、基因進(jìn)行GO及pathway分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程，涉及了JAK-STAT、ErbB、MAPK等信號(hào)通路。GRB2同時(shí)存在于基因芯片下調(diào)基因及miR-378靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)結(jié)果中，熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)證明miR-378可以調(diào)控GRB23'UTR，并且通過構(gòu)建GRB23'UTR突變載體證實(shí)了miR-378的結(jié)合位點(diǎn)。GRB2是與細(xì)胞增殖相關(guān)的MAPK信號(hào)通路上游激活因子，miR-378可能通