MiR-1和miR-133在山羊骨骼肌組織和細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及功能研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一組內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，由19-22個(gè)核苷酸組成，在病毒、動(dòng)物和植物等生物中廣泛存在。它可以通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)（3’UTR）堿基完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，使基因mRNA直接降解或者抑制其翻譯，導(dǎo)致基因在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生沉默，從而影響基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生以及脂類代謝等過程進(jìn)行調(diào)控。目前，關(guān)于miRNAs的研究仍處于初步階段，國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于

2、模式生物miRNAs的發(fā)現(xiàn)，以及其中與生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生相關(guān)的miRNAs的功能研究，而對(duì)于重要的家畜—山羊的miRNAs的研究則相對(duì)較少。本試驗(yàn)的目的在于通過分析 miR-1和miR-133及其靶基因（HDAC4和 SRF）在山羊骨骼肌的發(fā)育過程和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律以及功能研究，以了解其在山羊骨骼肌發(fā)育過程中的重要作用。
　　1.山羊miR-1和miR-133及其靶基因（HDAC4和SRF）時(shí)空表達(dá)規(guī)律研究。在影響山

3、羊生長(zhǎng)發(fā)育的眾多microRNAs中，選取了兩個(gè)重要的microRNAs（miR-1和miR-133）作為研究對(duì)象，并利用生物信息學(xué)方法篩選miR-1和miR-133在山羊生長(zhǎng)發(fā)育過程中可能的靶基因。通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)miR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在不同月齡的10個(gè)山羊組織（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、脂肪和背最長(zhǎng)?。┲械谋磉_(dá)規(guī)律。結(jié)果表明：miR-1和 miR-133在安徽白山羊和波爾山羊

4、各組織中差異表達(dá)即miR-1和miR-133在心臟和背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)量較高，而在其他組織中表達(dá)極低。另外，miR-1在山羊骨骼肌組織中的表達(dá)量隨著個(gè)體成熟表達(dá)減少，說明miR-1對(duì)肌肉的快速增長(zhǎng)極其重要，可以促進(jìn)肌纖維細(xì)胞的大量復(fù)制表達(dá)，到成體肌細(xì)胞增殖和分化都減弱時(shí)，表達(dá)相對(duì)減少。而miR-133隨著個(gè)體發(fā)育其表達(dá)量顯著增加，到成體時(shí)的表達(dá)量達(dá)到最高，說明成體肌細(xì)胞存在增長(zhǎng)的現(xiàn)象，且需要miR-133有較高的表達(dá)量來促進(jìn)其增殖。本

5、試驗(yàn)中miR-1和miR-133在安徽白山羊和波爾山羊中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，說明miR-1和miR-133與骨骼肌的發(fā)育有密切的聯(lián)系。
　　另外，miR-1和miR-133在波爾山羊和安徽白山羊骨骼肌組織中的表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）。
　　MiR-1和miR-133的靶基因(HDAC4和SRF)在安徽白山羊和波爾山羊各組織中的表達(dá)也存在差異即HDAC4和SRF在心臟和骨骼肌組織中的表達(dá)量較低，而在其他組織中的表達(dá)量相對(duì)較高

6、，這與miR-1和miR-133在安徽白山羊和波爾山羊骨骼肌組織中的表達(dá)量是截然相反的。除此之外，HDAC4和SRF在不同月齡的安徽白山羊和波爾山羊的骨骼肌組織中的表達(dá)趨勢(shì)與miR-1和miR-133類似，這說明miR-1和miR-133的表達(dá)量差異會(huì)對(duì)靶基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物骨骼肌的生長(zhǎng)與發(fā)育產(chǎn)生調(diào)控作用。
　　2. MiR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。通過實(shí)時(shí)定

7、量 PCR的方法檢測(cè) miR-1和 miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在F6、F9和F12代山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明：miR-1在F6、F9和 F12代山羊骨骼衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)量隨著細(xì)胞代數(shù)的增多表達(dá)量減少，而miR-133在山羊骨骼衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)量隨細(xì)胞代數(shù)的增多表達(dá)也隨之增多，這都與其在不同月齡的山羊骨骼肌中的表達(dá)趨勢(shì)相似。另外，靶基因HDAC4和SRF在F6、F9和F12代山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)趨

8、勢(shì)與miR-1和miR-133也是相似的。
　　3. MiR-1和miR-133對(duì)靶基因（HDAC4和SRF）的調(diào)控作用。為了提供更有力的證據(jù)來驗(yàn)證 HDAC4和 SRF基因是否是miR-1和 miR-133的靶基因，本研究將miR-1和miR-133 mimics轉(zhuǎn)染至山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，然后通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting的方法檢測(cè)HDAC4和SRF的mRNA表達(dá)水平和蛋白水平。首先利用miRNA neg

9、ative control（發(fā)紅光）進(jìn)行轉(zhuǎn)染條件的摸索，發(fā)現(xiàn)miRNA negative control的轉(zhuǎn)染濃度為100nM時(shí)，轉(zhuǎn)染的效率最高。結(jié)果表明，上調(diào)miR-1和miR-133的表達(dá)水平對(duì)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞HDAC4和SRF mRNA表達(dá)水平無明顯影響，但蛋白水平顯著降低。所以我們初步認(rèn)為miR-1和miR-133通過抑制山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞HDAC4和SRF基因的翻譯而非誘導(dǎo)HDAC4和SRF mRNA的降解抑制HDAC4和S