微小RNA miR-1和miR-206促進(jìn)成肌分化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、利用成體干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療或聯(lián)合基因治療是近幾年提出的修復(fù)組織損傷的新思路?；诔审w干細(xì)胞的治療策略能否安全、有效的達(dá)到目的在很大程度上取決于我們對(duì)成體干細(xì)胞增殖與分化的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞分化的核心問(wèn)題是基因表達(dá)在時(shí)間和空間上的精確調(diào)控，一種新的細(xì)胞表型的建立需要相關(guān)調(diào)控基因的打開(kāi)和關(guān)閉以適應(yīng)新的功能。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，一類(lèi)叫做microRNAs的非編碼小RNA分子，在調(diào)控特定細(xì)胞增殖、分化進(jìn)程等方面起著重要作用，特別是其在維持干細(xì)胞定

2、向分化和自我更新功能中的作用逐漸被揭示，成為目前干細(xì)胞研究中的一個(gè)新的亮點(diǎn)和熱點(diǎn)。某些miRNAs具有組織表達(dá)分布的特異性，提示它們與該組織的分化和特定功能的維持有關(guān)。早期的miRNAs克隆結(jié)果和基于高通量芯片的組織表達(dá)譜分析顯示，miR-1，miR-133和miR-206在小鼠的肌肉組織呈特異性表達(dá)，而它們?cè)诩∪獍l(fā)育、增殖和分化中的作用尚知之不多。明確這些miRNAs在成體干細(xì)胞增殖分化中的作用，將為我們利用成體干細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)肌損傷修

3、復(fù)治療提供新的線(xiàn)索。 本課題擬利用肌母細(xì)胞C2C12體外成肌分化模型，檢測(cè)肌肉組織特異性表達(dá)的miRNAs在成肌分化中的表達(dá)變化，通過(guò)gain-of-function觀察部分肌肉組織特異性表達(dá)的miRNAs對(duì)成肌分化的影響，并利用生物信息學(xué)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段預(yù)測(cè)、分析和驗(yàn)證它們可能的靶基因，同時(shí)檢測(cè)這些miRNAs在某些肌肉損傷過(guò)程中的表達(dá)變化，并構(gòu)建相應(yīng)的治療性載體，初步探討其在促進(jìn)成肌分化中的意義，為進(jìn)一步探明miRNAs調(diào)控骨

4、骼肌增殖與分化的分子機(jī)制、探索成體干細(xì)胞定向分化的新策略提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究?jī)?nèi)容主要包括三部分： 一、肌肉組織特異性miRNAs在C2C12細(xì)胞體外成肌分化過(guò)程中的表達(dá)改變 建立C2C12細(xì)胞體外成肌分化和以TNF-α為干預(yù)因素的抑制分化模型，通過(guò)形態(tài)學(xué)改變，肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學(xué)和肌分化相關(guān)基因的RT-PCR對(duì)上述模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用Northern blot檢測(cè)肌肉組織特異性的miR-1、mi

5、R-133和miR-206在上述模型的表達(dá)變化情況。 二、miR-1和miR-206促進(jìn)成肌分化的作用和機(jī)制研究 根據(jù)上述研究結(jié)果并結(jié)合最新進(jìn)展，確定進(jìn)一步深入研究miR-1和miR-206在成肌分化過(guò)程中的功能?；瘜W(xué)合成miR-1和miR-206，將其以200nM的濃度分別轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞，形成gain-of-function狀態(tài)后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，采用形態(tài)學(xué)、肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學(xué)和肌肉功能蛋白skeletal

6、-α-actin的Western blot對(duì)其分化效應(yīng)評(píng)價(jià)。 采用生物信息學(xué)方法，利用軟件PiTar、miRanda和TargetScan4.2分析miR-1和miR-206可能作用的候選靶基因。根據(jù)上述研究結(jié)果并結(jié)合最新進(jìn)展，分析候選靶基因在成肌分化過(guò)程中及過(guò)表達(dá)miR-1和miR-206后的變化特點(diǎn)，進(jìn)一步篩選與miR-1和miR-206表達(dá)相關(guān)聯(lián)的基因。 利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證候選靶基因。為了明確熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

7、的敏感性和特異性，構(gòu)建陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pmiR-206-Luc reporter。將位于候選靶基因3‘UTR含有預(yù)測(cè)miR-1和206作用位點(diǎn)約500bp區(qū)域克隆至pMIR-Lac內(nèi)熒光素酶3'UTR，并進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。 三、檢測(cè)肌肉組織特異性miRNAS在骨骼肌失神經(jīng)萎縮中的表達(dá)變化并構(gòu)建miR-1的腺病毒表達(dá)載體進(jìn)行促成肌分化的初步研究。 建立小鼠腓腸肌去神經(jīng)支配萎縮模型，Northern blot檢測(cè)miR-1、m

8、iR-133和miR-206在該模型的表達(dá)變化。著眼于以后的治療應(yīng)用，利用PCR從小鼠基因組擴(kuò)增含有miR-1-1的DNA片段，連接至pAdTrack-CMV中后轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1的感受態(tài)BJ5183，通過(guò)同源重組獲得腺病毒載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293包裝病毒顆粒，Northern blot驗(yàn)證成熟miR-1表達(dá)情況。利用miR-1重組腺病毒感染C2C12細(xì)胞，誘導(dǎo)分化72h通過(guò)形態(tài)學(xué)、肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學(xué)和肌肉功能蛋白skele

9、tal-α-actin的Western blot等指標(biāo)評(píng)價(jià)其對(duì)分化的影響。 通過(guò)以上三部分的實(shí)驗(yàn)研究與分析，獲得以下主要結(jié)果： 1、成功建立C2C12細(xì)胞體外成肌分化和以TNF-α為干預(yù)因素的抑制分化模型。C2C12細(xì)胞以2％馬血清進(jìn)行成肌分化誘導(dǎo)，3-5d可見(jiàn)多核肌管，MHC免疫熒光呈胞漿陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)myoD、myoG和skeletal-α-actin分化相關(guān)基因誘導(dǎo)分化后表達(dá)明顯上調(diào)，證實(shí)我們所建立的C2C

10、12細(xì)胞成肌分化模型是成功的。另一方面，觀察到TNF-α是C2C12細(xì)胞成肌分化的負(fù)向調(diào)控因子。TNF-α作用后上述成肌分化相關(guān)的標(biāo)志分子均不同程度受到抑制，建立了應(yīng)用TNF-α抑制成肌分化的模型，用于后續(xù)研究。 2、明確了肌肉組織特異性miRNAs miR-1，miR-133和miR-206在上述模型的表達(dá)變化。在正常成肌分化模型中三者隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，在分化過(guò)程中表達(dá)量升高明顯；在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中加入20ng/mlTNF-

11、α后成肌分化受抑，三者表達(dá)也受到明顯抑制。 3、揭示miR-1和206能夠促進(jìn)成肌分化。在C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染化學(xué)合成miR-1和206后24h進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)48h后進(jìn)行效應(yīng)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，在TNF-α(-)組，轉(zhuǎn)染miR-1和206后與陰性對(duì)照比較，MHC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯較多，skeletal-α-actin水平分別為對(duì)照的1.37倍和1.23倍。在TNF-α(+)組，各組MHC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯少于TNF-α(-)組，轉(zhuǎn)染m

12、iR-1和206后與陰性對(duì)照比較，MHC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明較多，skeletal-α-actin表達(dá)水平分別為對(duì)照的2.08倍和1.69倍，加入TNF-α這一干預(yù)因素后，凸顯了miR-1和206的促分化效應(yīng)。 4、發(fā)現(xiàn)CCND1和FOXP1是miR-1和miR-206作用的靶基因。利用在線(xiàn)生物信息學(xué)軟件PiTar、miRanda和TargetScan4.2預(yù)測(cè)miR-1和miR-206可能作用的靶基因，并結(jié)合其在成肌分化過(guò)程中的表達(dá)

13、變化特點(diǎn)確定CCND1和FOXP1兩個(gè)基因做進(jìn)一步深入研究。進(jìn)一步通過(guò)gain-of-function研究證實(shí)CCND1和FOXP1符合靶基因的表達(dá)變化特點(diǎn)。進(jìn)而，將CCND1和FOXP1的3'UTR含有預(yù)測(cè)作用位點(diǎn)約500bp的片段常規(guī)方法連接到pMIR-Luc的熒光素酶3'UTR，成功構(gòu)建pmiR-Luc-CCND1-3'UTR、pmiR-Luc-FOXP1-YUTR-1和pmiR-Luc-FOXP1-3'UTR-2等3個(gè)重組質(zhì)粒。

14、分別與pMIR-β-gal及合成之miRNAs共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，計(jì)算分析Luc/β-gal值，結(jié)果顯示，對(duì)pmiR- Luc-CCND1-3’UTR miR-1和miR-206可使其熒光素酶活性分別下降47.7％和39.3％；對(duì)pmiR-Luc-FOXP1-3'UTR-2 miR-1和miR-206可使其熒光素酶活性分別下降46.9％和40.7％；miR-1和miR-206未對(duì)pmiR-Luc-FOXP1-3'UTR-1的熒光素酶活性造

15、成影響。 5、明確在小鼠腓腸肌去神經(jīng)支配所致骨骼肌萎縮過(guò)程中肌肉組織特異性miRNAs的表達(dá)變化情況。與對(duì)照組相比，miR-206隨著失神經(jīng)支配時(shí)間的延長(zhǎng)其在肌肉組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，第28d其強(qiáng)度可達(dá)到對(duì)照的5倍以上；miR-1和miR-133隨著失神經(jīng)支配時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)先迅速下調(diào)，而后逐漸回升，但至失神經(jīng)支配后第28d仍明顯低于正常水平。 6、成功構(gòu)建miR-1的腺病毒表達(dá)載體，并初步觀察利用其促進(jìn)C2C12分化的

16、作用，為以后利用其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療打下基礎(chǔ)。利用PCR在小鼠基因組中擴(kuò)增含有miR-1-1的DNA片段，正確連接至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，然后轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒pAdEasy的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，通過(guò)同源重組產(chǎn)生腺病毒載體質(zhì)粒pAdEasy/miR-1-1，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后包裝出重組腺病毒pAd-miR-1-1，感染293后行Northern blot驗(yàn)證成熟miR-1分子能夠高效表達(dá)。制備高滴度病毒顆粒感染C2C12，誘

17、導(dǎo)成肌分化72 h進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，感染Ad-miR-1后MHC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，skeletal-α-actin水平為對(duì)照的1.21倍；加入TNF-α后，Ad-miR-1組細(xì)胞MHC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，α-actin接近對(duì)照不加入TNF-α的水平，表明Ad-miR-1可以明顯促進(jìn)成肌分化。 研究結(jié)論如下： 1、成功建立C2C12細(xì)胞體外成肌分化和TNF-α干預(yù)分化的模型，明確了肌肉組織特異性miRNAs在上述模型的