miR-1對軟骨細胞增殖分化的影響.pdf

1、研究背景
　　骺板軟骨內(nèi)源性成骨過程決定肢體的長度，一旦受損會影響肢體的正常發(fā)育。據(jù)統(tǒng)計16歲以下兒童長骨損傷累及骺板的約占15％-30%，其中1%-2%的骺板損傷會引起骺板早閉，導致肢體生長障礙及畸形，難以治療。目前研究認為，內(nèi)源性成骨實際上是一個復雜的細胞增殖與分化的過程，而這些變化都是以細胞基因精確表達的形式實現(xiàn)的。最近研究，這些基因的表達受控于microRNAs（miRNAs）。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在心肌、骨骼肌中特異性

2、高表達，能促進其正常發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)miR-1在骺板軟骨中特異性高表達，那么miR-1是否能調(diào)控軟骨細胞的增殖和分化，目前還不清楚。
　　故本實驗選擇分離雞胚胸骨增殖區(qū)軟骨細胞，分別通過用外源性的miR-1及其抑制劑進行轉(zhuǎn)染，使miR-1過表達和相應沉默來觀察其對軟骨細胞增殖和分化的影響。
　　方法
　?。?）取16日齡的雞胚，取其胸骨并分離增殖區(qū)軟骨細胞，進行原代培養(yǎng)并按120nM進行miR-1/antimiR-1及

3、其對照劑的細胞轉(zhuǎn)染。（2）通過Elisa技術(shù)檢測蛋白多糖、Ⅱ型膠原、MMP-13及TIMP-1在蛋白水平上變化，觀察過表達/沉默miR-1對軟骨細胞表型維持的影響。（3）利用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后，不同時間點miR-1對軟骨細胞增殖能力的影響；同時對軟骨細胞增殖明顯的時間點利用流式細胞技術(shù)對其進一步驗證。（4）通過Realtime-PCR技術(shù)檢測Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、Sox9、Ihh以及MMP-13等指標的變化，在基因水平上觀察過表達/沉

4、默miR-1對軟骨細胞表型維持、增殖和分化的影響。
　　結(jié)果
　　分離培養(yǎng)雞胚胸骨增殖區(qū)軟骨細胞，以1×105/ml的密度接種在6孔板中在37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待細胞達70%的融合后進行miR-1/antimiR-1及其對照劑的轉(zhuǎn)染。（1）軟骨細胞增殖：①軟骨細胞表型維持：Realtime-PCR檢測：miR-1過表達Ⅱ型膠原和Sox9等指標在基因水平上表達量增加；而MMP-13在基因水平上表達下降（P﹤0.05）。抑制miR

5、-1后，Ⅱ型膠原和Sox9等指標在基因水平上表達量下降；而MMP-13在基因水平上表達增加（P﹤0.05）。Elisa證明：miR-1過表達蛋白多糖、Ⅱ型膠原及TIMP-1在蛋白水平表達增高；MMP-13在蛋白水平表達降低（P﹤0.05）。而抑制miR-1后，蛋白多糖、Ⅱ型膠原及TIMP-1在蛋白水平表達降低；MMP-13在蛋白水平表達增高（P﹤0.05）。②軟骨細胞增殖：CCK-8技術(shù)顯示：miR-1過表達能促進軟骨細胞的增殖（P﹤0

6、.05），而抑制miR-1后，軟骨細胞的增殖能力下降（P﹤0.05）。流式細胞技術(shù)驗證：miR-1過表達使處于S期、G2期的細胞明顯增加，而抑制miR-1后，處于S期、G2期的細胞顯著下降（P﹤0.05）。（2）軟骨細胞分化：Realtime-PCR檢測：miR-1過表達：Ⅱ型膠原、Sox9和Ihh的基因表達顯著上調(diào)；而Ⅹ型膠原的表達顯著下降（P﹤0.05）。而抑制miR-1后，Ⅱ型膠原、Sox9和Ihh的基因表達顯著下降；而Ⅹ型膠原的