吡咯喹啉醌對促進軟骨細胞增殖及抑制IL-1β介導的軟骨細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　觀察吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)對促進兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖及對IL-1β介導的軟骨細胞凋亡的影響，以探討PQQ在保護軟骨細胞方面的作用機制。
　　方法:
　　1.在無菌的環(huán)境下取1月齡的新西蘭白兔的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，加入0.2％的Ⅱ型膠原酶對其進行消化，消化完成后用200目鋼網(wǎng)過濾、離心、重懸軟骨細胞于含10％FBS及1％雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)液中，然后放于3

2、7℃，5％ CO2孵箱中培養(yǎng)軟骨細胞。
　　2.倒置相差顯微鏡下觀察原代軟骨細胞自接種到培養(yǎng)皿中開始直到基本長滿培養(yǎng)皿底部時的不同時期的形態(tài)。
　　3.取第2代對數(shù)生長期的軟骨細胞，調(diào)整至合適的細胞密度，細胞貼壁后用PQQ濃度分別為0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0μ mol/L的無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)軟骨細胞48h，采用MTT法來檢測軟骨細胞的增殖活力。
　　4.將第2代對數(shù)生長期的軟骨細胞調(diào)至適當

3、密度后接種于6個100mm培養(yǎng)皿中，24h貼壁后，棄上清，分別加用PQQ濃度為0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0μ mol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30h，收集軟骨細胞，取1ml的單細胞懸液離心去掉上清，加入70％冷乙醇500μl固定，4℃過夜，PBS洗去固定液，加入100μlRNaseA37℃水浴30min，再加入400μ l的Propidium Iodide染色混勻后用流式細胞儀檢測細胞周期，計算軟骨細胞增殖指數(shù)

4、。
　　5.在100mm培養(yǎng)皿中接種軟骨細胞，細胞貼壁后用PQQ濃度分別為0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0μ mol/L無血清培養(yǎng)基預(yù)處理軟骨細胞24h，然后加入終濃度為10 ng/mL的IL-1β，繼續(xù)作用15h，收集上清液，與用0.25％的胰酶（不含EDTA）消化收集后的細胞懸液混合，離心，預(yù)冷PBS洗滌細胞，加入200μ l的BindingBuffer懸浮細胞，然后加入5μl的AnnexinⅤ-FITC

5、(AV)混勻，繼續(xù)加入5μl PropidiumIodide(PI)混勻，避光、室溫孵育15min，加入300μl Binding Buffer輕輕混勻。采用流式細胞術(shù)測軟骨細胞的凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.實驗中的軟骨細胞貼壁后細胞呈現(xiàn)三角形、多角形或不規(guī)則形，當軟骨細胞生長連接成片時可見呈現(xiàn)“鋪路石樣”。
　　2.MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組相比軟骨細胞的增殖活力隨PQQ濃度的增加而成逐漸升高的趨勢，差異具有統(tǒng)計

6、學意義(P＜0.05)，在PQQ濃度為25.0μ mol/L時達到最大值，50.0μ mol/L和100.0μ mol/L時細胞增殖活力下降。
　　3.PQQ能明顯提高軟骨細胞的增殖活力、S(％)期，G2/M(％)的比例和軟骨細胞的增殖指數(shù)(P＜0.05)，且在PQQ濃度為12.5μ mol/L和25.0μ mol/L時作用最強。
　　4.PQQ能明顯抑制IL-1β介導的軟骨細胞早期凋亡和晚期凋亡(P＜0.05)，在PQQ濃