凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶原激活因子和細(xì)胞黏附蛋白基因的克隆與序列分析.pdf

1、無(wú)脊椎動(dòng)物沒(méi)有真正的抗體和獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠先天性免疫系統(tǒng)來(lái)抵御外來(lái)病原微生物的侵害。酚氧化酶原激活系統(tǒng)(pro-PO)是無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫機(jī)制中具有重要作用的免疫系統(tǒng)。酚氧化酶原激活因子(PPAF)和細(xì)胞黏附蛋白(PX)基因是酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的兩個(gè)重要因子，這些免疫相關(guān)因子是如何抵御病原微生物入侵，如何參與機(jī)體的免疫活動(dòng)一直以來(lái)受到廣泛關(guān)注，因此本研究通過(guò)RACE方法首次克隆了PPAF的cDNA全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào)JQ

2、684529)，及PX基因的部分序列，并對(duì)2個(gè)基因序列進(jìn)行初步分析;通過(guò)半定量PCR分別對(duì)2個(gè)基因進(jìn)行了不同組織的表達(dá)譜分析，研究結(jié)果如下:
　　 1.PPAF基因cDNA全長(zhǎng)1986 bp，其中含有一個(gè)1629bp開放閱讀框(ORE)，兩翼分別存在21bp(5'端)和336bp(3'端)的非翻譯區(qū)。該基因的開放閱讀框共編碼542個(gè)氨基酸，以SMART軟件分析該氨基酸序列，269-517a區(qū)域是其功能域，是胰蛋白酶家族的絲氨酸蛋

3、白酶;494-502a區(qū)域有一個(gè)ALPHA-2巨球型免疫蛋白功能位點(diǎn);316-321a區(qū)域有一個(gè)組氨酸酶活性位點(diǎn)。進(jìn)化樹分析表明凡納濱對(duì)蝦PPAF基因與斑節(jié)對(duì)蝦的同源性最高，與果蠅、蚊的同源性最低。通過(guò)半定量PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在正常對(duì)蝦的心臟、肝胰腺、腸、胃和肌肉中的表達(dá)量沒(méi)有差別，血液中的表達(dá)量明顯高于其他組織;在感染IHHNV病毒的對(duì)蝦的組織中的表達(dá)量下降明顯，但是血液中的表達(dá)量仍明顯高于其他組織。
　　 2.PX基因部分

4、cDNA序列長(zhǎng)度為1529bp，分析發(fā)現(xiàn)該序列含有1個(gè)1308bp的開放閱讀框(ORF)，3'端含有1個(gè)長(zhǎng)度為221bp的非翻譯區(qū)，開放閱讀框共編碼436個(gè)氨基酸。所獲得的PX氨基酸序列理論等電點(diǎn)為4.64，分子量為48.86945KDa。經(jīng)Signal P軟件分析發(fā)現(xiàn)此氨基酸序列在72-86a區(qū)域有信號(hào)肽特征，82a是信號(hào)肽剪切位點(diǎn)的可能性最大。通過(guò)Motif Scan程序?qū)ζ浒被嵝蛄羞M(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列在其336-378a處