凡納濱對(duì)蝦與WSSV侵染相關(guān)的細(xì)胞與基因功能分析.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)后,成為對(duì)蝦暴發(fā)性流行病的主要病毒性病原,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　WSSV是一種有囊膜病毒,其感染宿主細(xì)胞的第一步是囊膜與靶細(xì)胞膜的吸附,而后融合或者內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,完成對(duì)細(xì)胞的侵染,現(xiàn)已有多個(gè)蛋白被報(bào)道參與感染,但該病毒感染的分子機(jī)制尚不清晰,也沒有有效的防治手段。本論文圍繞解析WSSV感染宿主的分子機(jī)制為主要研究目的,分別從WSSV多個(gè)囊膜蛋白和凡納濱對(duì)蝦重要造血

2、功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Runt基因入手。通過熒光顯微鏡觀察WSSV各囊膜蛋白是否能引起宿主細(xì)胞的內(nèi)吞作用。并使用熒光微球技術(shù),通過已知的受體蛋白對(duì)WSSV囊膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證與WSSV感染相關(guān)的各蛋白之間的相互作用關(guān)系。同時(shí)研究凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄因子Runt在受到外界病原侵入后的表達(dá)變化,以及重組蛋白注入對(duì)蝦體內(nèi)對(duì)感染W(wǎng)SSV病毒后的相對(duì)保護(hù)情況。通過本論文的研究,以期為闡明WSSV的侵染機(jī)制及途徑奠定基礎(chǔ)。
　　本論文

3、的主要研究內(nèi)容包括以下五個(gè)部分:
　　1、WSSV囊膜蛋白介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn):FITC標(biāo)記的重組WSSV囊膜蛋白VP24,VP26, VP28,VP31和VP37介導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦不同組織細(xì)胞的內(nèi)吞作用鑒定。原代培養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦的血淋巴,淋巴器官,上皮組織和造血組織細(xì)胞,在體外遷出后,和FITC標(biāo)記的重組囊膜蛋白孵育,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),可以使血細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用的有VP24,VP28,VP31和VP37;可以使淋巴器官細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用

4、的有VP28和VP37;可以使甲殼下表皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用的有VP28,VP31和VP37;使造血組織細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用的有VP24,VP28和VP37。綜上所述,VP28和VP37均能單獨(dú)介導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用,在WSSV的侵染過程中發(fā)揮首要的入胞作用。
　　2、應(yīng)用熒光微球技術(shù)研究凡納濱對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞與偶聯(lián)熒光微球的重組 WSSV囊膜蛋白的相互作用,并探究AK,Rab7和BP53以及多克隆抗體對(duì)VP31,VP28和VP37進(jìn)入細(xì)

5、胞的影響作用。運(yùn)用EDC法偶聯(lián)熒光微球和重組囊膜蛋白,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測,結(jié)果顯示BP53對(duì)VP37進(jìn)入血細(xì)胞有抑制作用,而Rab7和AK對(duì)VP28和VP31進(jìn)入血細(xì)胞沒有起到抑制作用。VP28和VP37的多克隆抗體對(duì)VP28,VP37進(jìn)入細(xì)胞有明顯抑制作用,而對(duì)VP31抗體對(duì)VP31進(jìn)入細(xì)胞沒有抑制作用。說明血細(xì)胞對(duì)囊膜蛋白VP31的內(nèi)吞存在非特異性。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以推論,BP53作為VP37的受體在病毒侵染細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作

6、用,而Rab7可能作為一種細(xì)胞因子,與VP28相互結(jié)合參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)感染過程。
　　3、凡納濱對(duì)蝦Runt轉(zhuǎn)錄因子cDNA全長序列克隆:應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù),首次在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)中克隆并測序了一種Runt(lvrunt)基因全長。lvrunt cDNA全長1754bp,含有1個(gè)663bp長的開放閱讀框,編碼221個(gè)氨基酸,理論分子量為23.6 kDa,具有Ru

7、nt-family結(jié)構(gòu)域。對(duì)該基因的蛋白序列分析顯示,Lvrunt的氨基酸序列與軟尾太平喇蛄(Pacifastacus leniusculus)相似度為88.1％,與其它種類的氨基酸序列相似性在30%—52.4%范圍內(nèi),該蛋白表現(xiàn)較高的種間保守性。
　　4、lvrunt在凡納濱對(duì)蝦的組織表達(dá)特異性分析及注射對(duì)蝦造血激素(LvAST)和WSSV對(duì)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響:對(duì)凡納濱對(duì)蝦鰓、腸、肝胰腺、類淋巴、心臟、肌肉組織和血淋巴lvrunt

8、的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該基因幾乎特異性地在血淋巴細(xì)胞中表達(dá),而在其它組織中表達(dá)較低。肌肉注射重組蛋白 rLvAST6h后,或白斑綜合征病毒(WSSV)粗提液12h后均觀察到lvrunt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著提高。
　　5、凡納濱對(duì)蝦Runt的原核表達(dá)及其對(duì)WSSV感染的體外中和實(shí)驗(yàn):構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA-lvrunt,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli內(nèi),加入0.02%L-阿拉伯糖于37℃誘導(dǎo)表達(dá),通過SDS-PAGE和對(duì)