紅褐斑腿蝗酚氧化酶原基因的克隆、特性分析及表達(dá)研究.pdf

1、酚氧化酶原激活系統(tǒng)在昆蟲的先天性免疫防御過程中起著十分重要的作用。在先前的研究中,已克隆得到紅褐斑腿蝗一個(gè)酚氧化酶原基因亞基--CpPPO2。本文以紅褐斑腿蝗Catantops pinguis(St(a)l)為研究對(duì)象,采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)擴(kuò)增得到另一個(gè)酚氧化酶原基因亞基(CpPPO1)cDNA全長,并對(duì)CpPPO1進(jìn)行比對(duì)分析。通過PCR技術(shù)結(jié)合Northern blot的技術(shù)原理,研究酚氧化酶原基因(CpPPO1及CpP

2、PO2)在紅褐斑腿蝗11種組織的分布情況,比較了不同發(fā)育階段及不同季節(jié)時(shí)期兩者的表達(dá)差異及變化,同時(shí)采用大腸桿菌感染成蟲,以考查蝗蟲在應(yīng)對(duì)外來病原菌感染時(shí)酚氧化酶原基因的表達(dá)的變化。研究結(jié)果如下:
　　 1.通過RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到CpPPO1基因cDNA序列全長。CpPPO1cDNA序列全長為2347 bp,開放閱讀框?yàn)?187 bp,編碼728個(gè)氨基酸,推測該蛋白分子量為84,261 Da,等電點(diǎn)為6.91。

3、該基因含有其他昆蟲都具有2個(gè)保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn),位點(diǎn)內(nèi)包含6個(gè)保守的組氨酸殘基。與其它昆蟲酚氧化酶原基因不同的是,CpPPO1cDNA推導(dǎo)的蛋白含有長為21個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列,預(yù)示著其可能作為一種分泌蛋白行使相應(yīng)的功能。采用BLASTP同源序列搜索結(jié)果表明,紅褐斑腿蝗PPO1與東亞飛蝗PPO1有高達(dá)87％的同源性。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果也表明紅褐斑腿蝗與東亞飛蝗的親緣關(guān)系最近。
　　 2.研究CpPPO1及CpPPO2在

4、紅褐斑腿蝗11個(gè)不同組織中的分布情況,結(jié)果顯示CpPPO1僅在6個(gè)組織中表達(dá),在脂肪體及馬氏管中CpPPO1的表達(dá)最強(qiáng),而在氣管及直腸中表達(dá)較弱；CpPPO2在11個(gè)組織中均有不同水平的表達(dá),脂肪體及心臟組織中檢測到的表達(dá)最強(qiáng),在中腸及卵巢表達(dá)很弱。研究表明,CpPPO1及CpPPO2具有組織表達(dá)特異性。
　　 3.研究CpPPO1及CpPPO2在紅褐斑腿蝗不同齡期的表達(dá),結(jié)果顯示CpPPO1除在2齡后期,4齡前期中期不表達(dá),成

5、蟲1天,3天僅有極微弱的表達(dá)外,在不同齡期的其他階段均有不同程度的表達(dá),其中在1齡蝗蝻的前期及中期表達(dá)最強(qiáng)；CpPPO2在不同齡期各個(gè)階段均表達(dá),其中在5齡后期的表達(dá)最強(qiáng)。同一發(fā)育階段,CpPPO1與CpPPO2的表達(dá)水平不一致。研究紅褐斑腿蝗CpPPO1及CpPPO2在不同季節(jié)階段的表達(dá),結(jié)果顯示CpPPO1在在6月中旬,7月下旬,10月上下旬及12月上旬的表達(dá)量最高,而CpPPO2在1月份,5月上旬,七月下旬,十月中旬有最高的表達(dá)水

6、平。研究結(jié)果說明CpPPO1與CpPPO2在時(shí)間表達(dá)上具有特異性。
　　 4.研究紅褐斑腿蝗接受外源病原菌大腸桿菌(E.coli)感染后,酚氧化酶基因表達(dá)強(qiáng)度變化,結(jié)果表明處理組CpPPO1表達(dá)比未處理組強(qiáng),且隨著處理時(shí)間的延長,CpPPO1的表達(dá)逐漸增強(qiáng),并在處理后24 h和48 h得到兩個(gè)峰值；CpPPO2在處理24 h及48 h時(shí)表達(dá)最強(qiáng),其余三個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組CpPPO2的表達(dá)量較為一致,無明-顯上調(diào)或下調(diào)。紅褐斑腿