克氏螯蝦酚氧化酶原全長(zhǎng)cDNA的克隆與序列分析.pdf

1、近年來(lái)，全球性蝦蟹病害給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，從而引起了人們對(duì)蝦蟹自身免疫防御系統(tǒng)的關(guān)注。酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase activatingsystem，proPO激活系統(tǒng))是甲殼綱和昆蟲(chóng)綱動(dòng)物的識(shí)別和防御系統(tǒng)。PO活力的強(qiáng)弱與機(jī)體免疫有直接相關(guān)性，可作為衡量甲殼動(dòng)物免疫功能大小的一個(gè)指標(biāo)，人們只有真正了解了proPO激活系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)具體的激活過(guò)程，才可能提高評(píng)價(jià)動(dòng)物健康的診斷方法，也才可能更有利于找出

2、合適的方法以提高機(jī)體自身的防御功能。進(jìn)行proPO基因結(jié)構(gòu)的研究，是深入研究proPO在體內(nèi)表達(dá)調(diào)控的機(jī)制和免疫功能等的基礎(chǔ)。 比對(duì)甲殼綱動(dòng)物的proPO基因，在相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物proPOF和proPOR，提取克氏螯蝦血淋巴總RNA，用引物OligodT-anchor進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用proPOF和proPOR進(jìn)行RT-PCR，片段回收并克隆測(cè)序，獲得proPO基因的部分片段。采用RACE技術(shù)(Rapid Amplificm

3、ion cDNA Ends，RACE)進(jìn)一步獲得該基因的3’端和5’端序列。結(jié)果表明，克氏螯蝦proPO基因至少能產(chǎn)生4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其長(zhǎng)度分別為2356bp、2995bp、3535bp和3721bp；5’端非編碼區(qū)序列相同，長(zhǎng)154bp；3’端非編碼區(qū)序列不同，長(zhǎng)度分別為318bp、957bp、1497bp和1683bp；ORF序列長(zhǎng)1884bp，編碼627個(gè)氨基酸。該基因含有8個(gè)N-糖基化結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)硫羥酸酯結(jié)構(gòu)域(thiol-est

4、er-likemotif; GCGWPODHL)。酚氧化酶活性中心重要組成部分的2個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)、位于銅結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的6個(gè)組氨酸(131，135，167和301，305，341處)以及與銅結(jié)合位點(diǎn)相鄰的氨基酸序列高度保守。此基因的4個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列均無(wú)信號(hào)肽，4個(gè)序列均含有PolyA尾。序列proPO-1的3’端無(wú)加尾信號(hào)(AATAAA)；序列proPO-2的3’端有1個(gè)加尾信號(hào)(AATAAA)；序列proPO-3和proPO-4的3’端分別有

5、3個(gè)加尾信號(hào)(AATAAA)。 將克氏螯蝦與其它節(jié)肢動(dòng)物proPO基因編碼的氨基酸同源性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示克氏螯蝦P.clarki proPO基因與同是螯蝦屬的淡水螯蝦P.lenuisculus親緣關(guān)系最近，同源性在63.6％；其次是甲殼綱的其它動(dòng)物，同源性在48.3％～54.5％之間；與昆蟲(chóng)綱動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)些，同源性在31.9～36.5％之間。 計(jì)算克氏螯蝦proPO基因的密碼子使用頻率，并比較不同節(jié)肢動(dòng)物pro