凡納濱對(duì)蝦鈣蛋白酶M、B和D基因的克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、凡納濱對(duì)蝦是我國重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種，對(duì)蝦的生長速度直接決定養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)蝦幼體到成體的肌肉生長速度取決于肌蛋白的合成速度和降解速度。研究發(fā)現(xiàn)，肌細(xì)胞肌原纖維的降解是由鈣蛋白酶引起的，鈣蛋白酶系統(tǒng)的鈣蛋白酶抑制蛋白可以抑制肌細(xì)胞的分解，肌蛋白降解速度相對(duì)降低會(huì)導(dǎo)致肌肉生長速度的增加，也會(huì)提高攝入營養(yǎng)物質(zhì)的肌肉轉(zhuǎn)化效率。
　　 本研究通過RACE方法克隆了凡納濱對(duì)蝦的鈣蛋白酶B(Calpains，Calp-B)、鈣蛋白酶D(Ca

2、lpains，Calp-D)、鈣蛋白酶M(Calpains，Calp-M)基因的部分序列，并對(duì)3個(gè)基因的序列進(jìn)行了分析。結(jié)果如下:
　　 1.首次克隆獲得了凡納濱對(duì)蝦的Calp-M基因，通過設(shè)計(jì)簡并引物，從凡納濱對(duì)蝦的肌肉組織中獲得該基因，其cDNA序列長度為597bp，有一個(gè)507bp的開放閱讀框(ORF)，編碼169個(gè)氨基酸，通過氨基酸序列比對(duì)得知，凡納濱對(duì)蝦Calp-M編碼氨基酸的序列高度保守，與其他物種的相似性很高，達(dá)到

3、27.81％，因此確定該基因?yàn)榉布{濱對(duì)蝦的Calp-M基因。Calp-M屬于親水性蛋白，Calp-M蛋白理論等電點(diǎn)為4.656，分子量為19.350KDa。其NC值為46.54，α-螺旋區(qū)域(Alpha helix)占18.34％;β-折疊區(qū)域(Extendedstrand)27.81％;無規(guī)則卷曲區(qū)域(Random coil)53.85％;其發(fā)生磷酸化的激活位點(diǎn)分別為11個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、7個(gè)蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)、6個(gè)酪氨酸(T

4、yr)位點(diǎn)。
　　 2.克隆獲得了凡納濱對(duì)蝦Calp-B基因，用RACE的方法獲得了長度為1739bp的cDNA序列，921bp的開放閱讀框，編碼307個(gè)氨基酸，分子量為35.732KDa，等電點(diǎn)為6.502，該蛋白的氨基酸序列中含有39個(gè)堿性氨基酸，45個(gè)酸性氨基酸，96個(gè)疏水性氨基酸，63個(gè)極性氨基酸。通過氨基酸序列比對(duì)得知，凡納濱對(duì)蝦的Calp-B編碼氨基酸的序列高度保守。對(duì)凡納濱對(duì)蝦Calp-B氨基酸預(yù)測(cè)到該蛋白含有1個(gè)

5、完整的結(jié)構(gòu)域，組成的4個(gè)結(jié)構(gòu)域從N端起分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ結(jié)構(gòu)域。四個(gè)區(qū)域均可能存在1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，7個(gè)區(qū)域均為蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)N-肉豆蔻酰，其中磷酸化位點(diǎn)和磷脂結(jié)合域。其結(jié)構(gòu)域Ⅳ含有EF-手結(jié)構(gòu)，與鈣離子結(jié)合，調(diào)節(jié)其它生物活性。而通過對(duì)其信號(hào)肽分析得知，Calp-B是一種分泌蛋白，并且信號(hào)肽切割為點(diǎn)在33aa處，其跨膜區(qū)域，對(duì)其功能的發(fā)揮有一定的作用，Calp-B蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋區(qū)

6、域(Alpha helix)是由99個(gè)氨基酸組成，占32.25％;β-折疊區(qū)域(Extended strand)是由63個(gè)氨基酸組成，占20.52％;無規(guī)則卷曲區(qū)域(Random coil)是由145個(gè)氨基酸組成，占47.23％。NC值為49.744，由此表明Calp-B為一種表達(dá)量不是很高的內(nèi)源性基因。
　　 3.首次獲得凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)Calp-D基因的部分cDNA的序列，其cDNA序列長度為623bp，其編碼了307個(gè)氨基酸

7、的蛋白前體，分子量為9.082K Da，等電點(diǎn)為5.522，該蛋白的氨基酸序列中含有9個(gè)堿性氨基酸，12個(gè)酸性氨基酸，26個(gè)疏水性氨基酸，15個(gè)極性氨基酸;Calp-D屬于親水性蛋白，通過生物信息學(xué)分析得知:Calp-D能存在1個(gè)氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、N-肉豆蔻酰位點(diǎn)和細(xì)胞粘附位點(diǎn)。NC值為50.331，表明Calp-D表達(dá)量不是很高的內(nèi)源性基因，數(shù)據(jù)分析得知無規(guī)則螺旋占據(jù)大多