草魚NEDD4結(jié)合蛋白基因1(N4BP1)的克隆及功能分析.pdf

1、草魚是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，但是隨著養(yǎng)殖密度的增加和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，草魚養(yǎng)殖中病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了其發(fā)展。其中草魚出血病是一種危害較大的病毒性傳染病，草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)則是引起該病的主要病原。多年來，科研人員已對GCRV的形態(tài)特征、病毒基因組及蛋白晶體結(jié)構(gòu)、病毒蛋白功能、細(xì)胞敏感性等進(jìn)行了分析與鑒定，然而對病毒感染過程中草魚的免疫應(yīng)答機(jī)制，以及宿主與病毒間相互作用的研究還相對比較薄弱

2、。本論文以我國主要淡水養(yǎng)殖魚類之一草魚(ctenopharyngodon idellus)為研究對象，應(yīng)用同源性克隆和RACE-PCR技術(shù)克隆得到了草魚NEDD4結(jié)合蛋白基因1(NEDD4 binding protein1, N4BP1)，并命名為Ci N4BP1。該基因cDNA序列全長為1131 bp，5′非編碼區(qū)（5′-UTR）為98 bp，3′非編碼區(qū)（3′-UTR）為481 bp，開放閱讀框（open reading frame

3、，ORF）為552 bp，編碼183個氨基酸。預(yù)測分子量（MW）為19.8kDa，理論等電點（pI）為9.13。氨基酸序列分析結(jié)果表明CiN4BP1所編碼的氨基酸序列與稻田魚(Oryzias latipes)相應(yīng)基因編碼的氨基酸序列最高同源性為76％，進(jìn)化樹表明與斑馬魚(Danio rerio)相應(yīng)蛋白的親緣關(guān)系較近。在健康草魚體內(nèi)，CiN4BP1頭腎、胸腺、鰓、脾臟中表達(dá)量較高，而經(jīng)草魚呼腸孤病毒感染后，Ci N4BP1在頭腎、胸腺、

4、腦、脾臟、體腎、胃、肌肉和肝臟等組織中的表達(dá)量均有上調(diào)。進(jìn)一步的熒光定量 PCR結(jié)果表明，GCRV感染后草魚主要免疫器官（頭腎、體腎、脾臟、肝臟）以及CIK細(xì)胞中Ci N4BP1的表達(dá)量均隨著感染時間的延長逐漸升高。隨后，我們構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-N4BP1，導(dǎo)入大腸桿菌 BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化了最佳表達(dá)的溫度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時間，最終確定pET-N4BP1重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：37℃，0.06 mmol·L-

5、1 IPTG，誘導(dǎo)4 h。為了研究Ci N4BP1的亞細(xì)胞定位及其在GCRV感染中的作用，我們構(gòu)建了N4BP基因的真核表達(dá)載體pDsRed2-N4BP1，瞬時轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示CiN4BP1在主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。在此基礎(chǔ)上，我們用GCRV感染pDsRed2-N4BP1瞬時轉(zhuǎn)染的CIK細(xì)胞，并在不同時間點收樣檢測GCRV主要結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CiN4BP1過表達(dá)能夠抑制GCRV主要結(jié)構(gòu)基因VP6的轉(zhuǎn)