豌豆中NYE1基因的克隆及NYE1的功能分析.pdf

1、本課題組通過(guò)擬南芥滯綠突變體(nye1-1)篩選和圖位克隆,鑒定并克隆得到葉綠素降解代謝的關(guān)鍵調(diào)控基因AtNYE1。本研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù),在豌豆(Pisum sativum)中成功克隆了AtNYE1的同源基因PsNYE1,并對(duì)分離獲得的野生型黃豌豆PsNYE1及其突變體綠豌豆Psnyel的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行了克隆和功能互補(bǔ)研究。PsNYE1的cDNA全長(zhǎng)為1132bp,其中開(kāi)放讀碼框(ORF)長(zhǎng)786bp,編碼2

2、61個(gè)氨基酸。有趣的是,該基因與經(jīng)典遺傳學(xué)理論中孟德?tīng)栍^察到的豌豆黃綠子葉顏色的表型具有相關(guān)性。生物信息學(xué)分析表明,PsNYE1基因的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列與擬南芥葉綠素降解代謝關(guān)鍵調(diào)控基因AtNYE1有66％的較高相似性。為了驗(yàn)證PsNYE1基因的功能,將黃豌豆PsNYE1和綠豌豆Psnyel786bp的編碼區(qū)序列分別構(gòu)建到帶有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S組成型強(qiáng)啟動(dòng)子和擬南芥衰老特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子SAG12的植物表達(dá)載體pG

3、reen載體上,采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌,通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥滯綠突變體nye1-1。互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PsNYE1基因能夠異源互補(bǔ)擬南芥滯綠突變體nye1-1的滯綠表型,而突變體Psnyel基因不能互補(bǔ)。
　　 獲得可溶性的NYE1蛋白對(duì)于探索NYE1功能是至關(guān)重要的。本研究通過(guò)嘗試多種方法,最終采用原核表達(dá)載體pMAL-c2X,原核表達(dá)菌株大腸桿菌RosettaPlus,通過(guò)適宜的誘導(dǎo)表達(dá)條件,獲得了可溶性的擬南芥NYE1融

4、合蛋白,這為進(jìn)一步研究NYE1蛋白的結(jié)構(gòu)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 另外,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),CRN1(_Co-_regulated with_NYE1)與NYE1具有較為相似的基因表達(dá)模式,CRN1在植物中有較高的保守性。通過(guò)對(duì)該基因T-DNA插入突變體crn1-1的研究發(fā)現(xiàn),crn1-1在自然衰老和黑暗誘導(dǎo)衰老過(guò)程中均具有滯綠表型,在黑暗誘導(dǎo)衰老過(guò)程中葉片光合速率在第三天迅速下降,由此鑒定crn1-1是C類(lèi)非功能型滯綠突變體。通