毛竹PeSnRK1a基因的克隆與功能分析.pdf

1、蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1(SnRK1)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，該基因已在很多植物中被克隆出來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)SnKR1在調(diào)節(jié)植物能量代謝和逆境脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用。
　　為了探究SnRK1蛋白激酶在毛竹中的特性，本研究克隆了毛竹PeSnRK1a基因，并對(duì)其在毛竹實(shí)生苗的各組織中的表達(dá)水平，以及脅迫條件下其在毛竹葉片中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);借助原核表達(dá)系統(tǒng)，在體外表達(dá)毛竹PeSnRK1a蛋白;對(duì)過表達(dá)PeSnRK1a基因

2、的擬南芥葉片進(jìn)行黑暗處理，對(duì)其種子進(jìn)行鹽脅迫處理并檢測(cè)其發(fā)芽率;主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過同源基因克隆的方法，從毛竹中成功克隆了SnRK1基因，命名為P eSnRK1a。基因序列分析結(jié)果表明:PeSnRK1a基因的開放閱讀框序列全長(zhǎng)含有1509個(gè)堿基，共編碼502個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為57.4kDa，等電點(diǎn)為8.67，為親水性氨基酸。同源序列對(duì)比分析結(jié)果顯示，PeSnRK1a與擬南芥、高粱、玉米和水稻等其它植物SnRK1同源

3、基因的同源性高達(dá)76.22％-92.29％。系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類結(jié)果顯示其與玉米ZmSnRK1a、高粱SbSnRK1a的親緣關(guān)系最近。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示:PeSnRK1a含有典型的STKc、UBA和KAI結(jié)構(gòu)域。
　　2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了PeSnRK1a基因在毛竹實(shí)生苗的組織部位的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示:PeSnRK1a在2月齡的毛竹實(shí)生苗的根、莖、葉中都有表達(dá)，且在葉中表達(dá)量最高;黑暗和鹽脅迫能夠誘導(dǎo)毛竹葉中PeS

4、nRK1a的表達(dá)。
　　3.構(gòu)建PeSnRK1a原核表達(dá)載體，在體外誘導(dǎo)表達(dá)PeSnRKla蛋白。結(jié)果表明:以BL21(DE3)和Rosetta(DE3)為表達(dá)菌株，采用pMal-c2x表達(dá)載體，以1mMIPTG為誘導(dǎo)劑，在誘導(dǎo)溫度分別為20℃，37℃的條件下，PeSnRK1a蛋白主要以包涵體的形式存在。
　　4.建立蛋白免疫印跡法檢測(cè)SnRK1蛋白激酶的活性的方法體系。以在大腸桿菌中表達(dá)純化的SAMS多肽作為SnRK1蛋白

5、激酶的底物，利用磷酸化抗體檢測(cè)SAMS多肽的磷酸化水平來(lái)檢測(cè)擬南芥SnRK1蛋白激酶的活性。
　　5.構(gòu)建了PeSnRK1a植物過表達(dá)載體，用花器浸泡法侵染擬南芥。與野生型擬南芥相比，過表達(dá)PeSnRK1a的擬南芥植株在正常培養(yǎng)條件下，在種子發(fā)芽時(shí)間，葉片形態(tài)特征，開花及衰老時(shí)間等方面沒有明顯差異。過表達(dá)PeSnRK1a基因的擬南芥的離體葉片在黑暗條件下可以延緩衰老。在含有100-200mM氯化鈉的培養(yǎng)基上，過表達(dá)PeSnRK1a