植物NPR1及NPR1-like基因的克隆與功能分析.pdf

1、NPR1(nonexpressor of PR gene)基因可調控植物廣譜抗性的發(fā)生，在植物系統(tǒng)抗性中起著關鍵作用。植物NPR1基因已成為植物抗病信號傳導途徑，以及植物抗病基因工程領域的研究熱點。從不同植物中克隆NPR1基因及NPR1-like基因，并進行基因表達特點和抗病功能的研究，對于豐富NPR1里論基礎和進一步在植物抗病基因工程中的應用都具有重要的意義。本文分別以棉花品種魯棉22和心葉煙為材料，從棉花植株中首次克隆出1個NPR1

2、同源基因(GhNPR1)，從心葉煙中首次克隆出2個NPR1同源基因(NgNPR1、NgNPR3)，在此基礎上，分別對它們的表達特點及其抗病的生物學功能進行了分析。具體結果如下： 1.根據(jù)同源序列設計簡并引物，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法從棉花(Gossypium hirsutum)中克隆到一個NPR1基因，命名為GhNPR1，GenBank注冊號為EF988657。通過對其分子結構和氨基酸結構的對比分析，證明該基因為

3、NPR1的同源基因。Southern雜交說明在棉花基因組中GhNPR1為單拷貝。Northern雜交發(fā)現(xiàn)GhNPR1在棉花中的表達不僅具有組織特異性而且還具有時間特異性。此外，植物抗病反應相關信號分子SA、MeJA、ET可以誘導GhNPR1的表達，同樣給棉花接種棉花枯萎病菌和角斑病菌后，發(fā)現(xiàn)GhNPR1的表達量也逐步增加，進一步證表明GhNPR1可能參與了棉花抗病反應的基因表達調控。 2.從心葉煙(Nicotiana gluti

4、nosa)中同源克隆了NPR1基因，命名為NgNPR1，GenBank注冊號為EU139477。利用同源序列對比及分析，證明該基因為NPR1的同源基因。并且通過NgNPR1-GFP亞細胞定位的研究，可以證明NgNPR1蛋白的結構特點與AtNPR1蛋白最為相近。RT-PCR檢測NgNPR1表達特性時，發(fā)現(xiàn)NgNPR1基因可以被信號分子SA、MeJA、H2O2和INA誘導表達，而且細菌性病害青枯病和真菌病害煙草立枯病菌、黑莖病菌和赤星病菌接

5、種心葉煙后，也可以不同程度的增加NgNPR1的表達量。這表明NgNPR1基因可能是SA依賴的信號轉導途徑的成員，參與心葉煙抗病反應的基因表達調控。 3.根據(jù)已知的NPR1及NPR1-like基因的同源序列，設計簡并引物，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法從心葉煙(Nicotiana glutinosa)中克隆得到了一個壇NgNPR1-like基因，命名為NgNPR3，GenBank注冊號為EF077161。同源對比分析發(fā)現(xiàn)

6、，NgNPR3與擬南芥中AtNPR3同源性最高，且氨基酸結構中具有幾個高度保守的典型序列結構。除此之外，NgNPR3基因組外顯子-內(nèi)含子結構位置的特征，也與已知的AtNPR3基因一致。因此推測NgNPR3基因是AtNPR3的同源基因。利用綠色熒光蛋白在洋蔥表皮瞬時表達的實驗，證明了NgNPR3蛋白可以通過SA、INA誘導而引起細胞內(nèi)氧化還原電位勢的變化，從細胞質運動到細胞核之中。Southern雜交說明在心葉煙基因組中壇NgNPR3為單

7、拷貝。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)分別利用信號分子SA、MeJA、H2O2和INA誘導，以及接種青枯病、立枯病菌、黑莖病菌和赤星病菌后，NgNPR3在心葉煙中的表達量都會出現(xiàn)明顯的增加，這意味著NgNPR3具有與NgNPR1基因相似的信號傳導和調控體系。 4.將NgNPR3構建正義植物表達載體pBI121-NgNPR3，采用農(nóng)桿菌介導的方法，轉化煙草NC89，同時轉空載體作為對照。經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株。經(jīng)過PCR鑒定，并選取部

8、分轉基因植株進行了Northern和Western雜交分析，結果證明NgNPR3在轉基因煙草中已成功得到表達。并且轉基因植株中存在三種不同的表達量，分別為高表達(H)、中表達(M)、低表達(L)。 5.選取具有代表性的三個T0代轉基因株系(H、M、L)進行自交種子擴繁，得到T1代轉基因植株。在分子鑒定基礎上，對T1代轉基因植株進行了生物學功能分析?？拐婢鷮嶒炛?，轉基因植株在接種了煙草白粉病菌后，其抗病能力與壇NPR3基因的表達量

9、成正比關系。即NgNPR3表達量高的植株(H、M)具有較高的抗性，低表達(L)植株與對照植株抗性很低。通過RT-PCR鑒定侵染后植株中PR基因的表達含量，證明高表達植株可以加快提高PR基因的表達，從而提高抗病能力。實驗結果說明SAR誘導后NgNPR3基因也是誘導下游PR基因表達的重要調控因子。 6.構建原核表達載體pET-NgNPR3，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達融合蛋白，將特異誘導帶切下，溶于PBS中獲得抗原，免疫小鼠