NEDD4蛋白調(diào)控AMPK活性參與心肌慢性缺氧適應(yīng)的研究.pdf

1、目的:
　　慢性缺氧是多種心臟疾病共同的病理生理過(guò)程，臨床常見(jiàn)的疾病包括紫紺型先天性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、代償性心肌肥厚、高原性心臟病等。在慢性缺氧過(guò)程中，心肌細(xì)胞面臨嚴(yán)重能量應(yīng)激、氧化應(yīng)激、鈣離子失衡等多種應(yīng)激。應(yīng)激作用導(dǎo)致心肌細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)重塑、體液內(nèi)環(huán)境改變等多種適應(yīng)性改變。既往研究證實(shí)，這些適應(yīng)性反應(yīng)可促使心肌細(xì)胞耐受多種外界刺激。目前，心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)的確切機(jī)制尚不完全清楚。
　　能量代謝調(diào)節(jié)是心肌細(xì)

2、胞慢性缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase，AMPK)是一種在真核細(xì)胞中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化AMPK可調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路增加心肌細(xì)胞能量的生成。AMPK被認(rèn)為是心肌細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵激酶。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因4蛋白(Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated prot

3、ein4,NEDD4)是一種含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，其結(jié)構(gòu)中的WW結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)識(shí)別活化AMPK結(jié)構(gòu)中的磷酸化蘇氨酸殘基而參與其活性調(diào)節(jié)。深入研究慢性缺氧時(shí)心肌細(xì)胞中NEDD4蛋白表達(dá)水平和AMPK活化水平的變化以及NEDD4蛋白對(duì)AMPK活性的可能調(diào)節(jié)作用，將有助于我們拓展對(duì)AMPK活性調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)。本研究以先天性心臟病患兒心肌組織和培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察在慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞中NEDD4蛋白表達(dá)水平和AM

4、PK活化水平的變化。同時(shí)，利用小干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)技術(shù)構(gòu)建NEDD4蛋白低表達(dá)細(xì)胞模型，觀察干擾NEDD4蛋白表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞缺氧耐受的影響。旨在通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)探討NEDD4蛋白對(duì)AMPK活性的調(diào)節(jié)作用對(duì)心肌慢性缺氧適應(yīng)的影響。
　　方法:
　　1.選取于2013年1月-2014年1月之間在第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管外科接受手術(shù)治療的先天性心臟病患兒，根據(jù)患者術(shù)前血氧飽和度分為紫紺

5、組和非紫紺組，取術(shù)中切除的肥厚右室流出道心肌組織作為臨床標(biāo)本，免疫組化染色觀察NEDD4蛋白在心肌組織中的表達(dá)分布情況;RIPA裂解法提取心肌標(biāo)本中的總蛋白，采用Westernblot法檢測(cè)兩組患兒心肌組織中NEDD4蛋白表達(dá)水平及AMPK活化水平變化。
　　2.在慢性缺氧條件下培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞。在不同缺氧時(shí)間段提取心肌細(xì)胞總蛋白，采用Western blot法檢測(cè)NEDD4蛋白表達(dá)水平和AMPK活化水平變化。同時(shí)將以H9c2

6、心肌細(xì)胞NEDD4蛋白基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，建立NEDD4蛋白低表達(dá)細(xì)胞模型，在慢性缺氧條件下(94％N2，5％CO2，1％O2)培養(yǎng)72h后Western blot法檢測(cè)NEDD4蛋白表達(dá)水平與AMPK活化水平變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.紫紺組先天性心臟病患兒術(shù)前氧飽和度明顯低于非紫紺組(P＜0.05)，免疫組化檢測(cè)提示NEDD4蛋白主要在心肌細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)。與非紫紺組相比，

7、紫紺組先天性心臟病患兒心肌組織中NEDD4蛋白表達(dá)水平較低(P＜0.05)，NEDD4蛋白表達(dá)水平與患者術(shù)前血氧飽和度呈正相關(guān)。
　　2.Westernblot結(jié)果顯示，與非紫紺組患兒相比，紫紺組先天性心臟病患兒心肌組織中AMPK活化水平（p-AMPK/AMPK蛋白條帶灰度比值）顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　3.在慢性缺氧條件下培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，Western blot結(jié)果證實(shí)，NEDD4蛋白表達(dá)水平隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)

8、而降低(P＜0.05)，至缺氧24 h時(shí)降至最低值，此后維持這一低水平表達(dá);AMPK活化水平隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P＜0.05)，在缺氧48 h時(shí)達(dá)最大值，此后維持這一高活化水平;NEDD4蛋白表達(dá)水平與AMPK活化水平變化趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示:與常氧組相比，缺氧組心肌細(xì)胞凋亡比例顯著增加(P＜0.05)，但干擾NEDD4蛋白表達(dá)后，缺氧所致心肌細(xì)胞凋亡比例降低(P＜0.05);Westernblot

9、結(jié)果提示，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，干擾轉(zhuǎn)染組NEDD4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而AMPK活化水平顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.與非紫紺型先天性心臟病患兒相比，紫紺型先天性心臟病患兒心肌組織中NEDD4蛋白表達(dá)水平較低，AMPK活化水平增強(qiáng)。
　　2.在慢性缺氧條件下培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，與常氧組相比，慢性缺氧組心肌細(xì)胞中NEDD4蛋白表達(dá)水平降低，AMPK活化水平增強(qiáng)。
　　3.慢性缺氧